تم اختبار طريقة الكشف ونظام ألوان قياس التدفق الخلوي ل TPFS الخاص بفيروس التهاب الدماغ الياباني لتوفير مرجع لدراسات مماثلة. سيتم تنفيذ عرض الإجراء من قبل Linlin Zhang و Meng Zhang ، وهما طالبان من مختبرنا. للبدء ، قم بتحفيز PBMCs لمجموعة تحفيز JEV بجزيئات JEV المعطلة المركزة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود أجسام مضادة وحيدة النسيلة ، CD28 و CD49d و CD107a و GolgiPlug و monensin.
بعد ذلك ، قم بتحفيز PBMCs للمجموعة الضابطة بدون جزيئات فيروس مركزة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود أجسام مضادة وحيدة النسيلة ، CD28 و CD49d و CD 107a و GolgiPlug و monensin. اجمع تعليق الخلية من كل مجموعة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 500 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة الطافي مع ماصة.
إعادة تعليق الخلايا في 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف صبغة قابلة للتثبيت إلى تعليق الخلية واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. جهاز طرد مركزي عند 500 غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، وإزالة المادة الطافية.
بعد إعادة تعليق الخلايا في 1 ملليلتر من PBS ، مرة أخرى ، يتم تشغيل جهاز طرد مركزي عند 500 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق والتخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا. لإجراء تلطيخ علامة سطح الخلية ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS ، وأضف ميكرولترين من كل جسم مضاد لعلامة السطح إلى تعليق الخلية في كل أنبوب. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتها من الضوء.
جهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية كما هو موضح سابقا. مرة أخرى ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي عند 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية بعناية.
لإجراء التثبيت وكسر الغشاء ، أعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول تثبيت كسر الغشاء وثبت الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. ثم الطرد المركزي في 500 غرام لمدة خمس دقائق وإزالة طاف. بعد إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من PBS ، يتم الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 غرام في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية بعناية ، كما هو موضح سابقا.
بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS وأضف ميكرولترين من كل جسم مضاد للسيتوكين إلى معلق الخلية في كل أنبوب لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. مرة أخرى ، جهاز طرد مركزي عند 500 جرام لمدة خمس دقائق ، وإزالة المادة الطافية كما هو موضح سابقا.
مرة أخرى ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية بعناية كما هو موضح سابقا. ثم أضف 500 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق الخلايا.
بعد عزل عينة PBMC وحدها ، كما هو موضح سابقا ، قسم معلق الخلية إلى 12 جزءا متساويا في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر موصوفة في المخطوطة. وبالمثل ، بعد إضافة علامات سطح الخلية والجسم المضاد للسيتوكين داخل الخلايا ، كما هو موضح سابقا ، أضف 500 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق الخلايا والدوامة بسرعة منخفضة. باستخدام عينة غير ملوثة ، اضبط التشتت الأمامي والتشتت الجانبي وجهد صبغة الفلورسنت المختلفة ، مع ضبط تعويض قياس التدفق الخلوي للتخلص من إشارات التلوث بين الفلوروفورات المختلفة ، باستخدام عينات تلطيخ واحدة.
ارسم بوابة مضلعة من خلال منطقة التشتت الأمامية ، ومخطط نقطي لمنطقة التشتت الجانبية لتحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية السليمة ، مع استبعاد الحطام ، وبوابة مستطيلة عبر منطقة التشتت الأمامية ، ومخطط نقطي عرض التشتت الأمامي لتحديد الخلايا المفردة. بعد ذلك ، ارسم بوابة مستطيلة من خلال مخطط نقطة منطقة التشتت الحية والميتة لتحديد الخلايا الحية ، وبوابة مستطيلة من خلال مخطط نقطة منطقة التشتت الجانبية CD3 لتحديد الخلايا التائية الإيجابية الثلاث للقرص المضغوط. بعد ذلك ، ارسم بوابة رباعية من خلال مخطط CD4 و CD8 النقطي لتحديد الخلايا التائية الموجبة CD4 أو CD8 الموجبة ومن خلال مخطط CD45RO و CD27 النقطي لتقسيم الخلايا التائية الموجبة CD4 أو CD8 الموجبة إلى TCM و TEM.
بعد رسم بوابات CD107a ، إنترفيرون جاما ، عامل نخر الورم ألفا ، إنترلوكين 2 وبروتين التهاب ميكروفاج واحد ألفا من TCM أو TEM للخلايا التائية الإيجابية CD8 أو CD4 الإيجابية لتحديد تواتر أنماط الاستجابة المختلفة على التوالي. قم بتحميل العينات على القياس الخلوي بالتتابع. تم استخدام استراتيجية البوابة لتحديد TCM أو TEM للخلايا التائية الموجبة CD8 أو CD4 الإيجابية ومجموعاتها الفرعية باستخدام عرض منطقة التشتت الأمامي ، ثم مخطط نقطة منطقة التشتت الجانبية.
أشار التوصيف الوظيفي المتعدد لاستجابات الخلايا التائية الإيجابية CD4 و CD8 الإيجابية ل JEV إلى أنه تم اكتشاف مستويات متزايدة من CD107a وإنترفيرون جاما وعامل نخر الورم ألفا وإنترلوكين 2 في خلايا الطب الصيني التقليدي الإيجابية CD8 للأطفال الذين تم تطعيمهم بعد تحفيز JEV مقارنة بتلك الموجودة في الأطفال غير الملقحين. ومع ذلك ، فإن مستوى البروتين الالتهابي البلاعم واحد ألفا لم يختلف بين المجموعتين. تم الكشف عن مستويات أعلى من CD107a وإنترفيرون جاما في خلايا TEM الإيجابية CD8 للمجموعة الملقحة تحت تحفيز JEV مقارنة بالمجموعة غير الملقحة.
في حين أن عامل نخر الورم ألفا ، إنترلوكين 2 وبروتين التهاب البلاعم واحد ألفا ، لم تكن مرتفعة بشكل ملحوظ في تلك الخلايا الإيجابية. نجح مستضد JEV في إحداث مستويات أعلى من CD107a ، وجاما الإنترفيرون ، وعامل نخر الورم ألفا ، وبروتين التهاب البلاعم واحد ألفا في خلايا الطب الصيني التقليدي الإيجابية CD4 للمجموعة الملقحة مقارنة بالمجموعة غير الملقحة. ومع ذلك ، فإن نسبة الخلايا الإيجابية إنترلوكين 2 لم تختلف بين المجموعتين تحت تحفيز JEV.
كانت نسبة مجموعات فرعية إيجابية CD107a وإيجابية غاما إنترفيرون وعامل نخر الورم ألفا الإيجابي وخلايا TEM الإيجابية CD4 الفرعية في المجموعة الملقحة أعلى في وجود JEV ، مقارنة بالمجموعة غير الملقحة. تعد مناعة الخلايا التائية للمنبهات واستراتيجيات مطابقة الألوان المتوافقة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول.
