일본뇌염 바이러스 특이적 TPFS의 검출 방법 및 유세포분석 색 체계를 시험하여 유사한 연구에 대한 참고 자료를 제공하였다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 두 학생 인 Linlin Zhang과 Meng Zhang이 수행합니다. 시작하려면 단일 클론 항체, CD28 및 CD49d, CD107a, 골지플러그 및 모넨신의 존재하에 섭씨 37도에서 16시간 동안 농축된 비활성화된 JEV 입자로 JEV 자극 그룹의 PBMC를 자극합니다.
이어서, 바이러스 입자가 농축되지 않은 대조군의 PBMCs를 모노클로날 항체, CD28 및 CD49d, CD 107a, 골지플러그 및 모넨신의 존재하에 섭씨 37도에서 16시간 동안 자극하였다. 각 그룹으로부터 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 수집한다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고, 피펫으로 상층액을 제거한다.
세포를 PBS 1밀리리터에 재현탁시킨다. 고정 가능한 생존 염료를 세포 현탁액에 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 10 분 동안 배양합니다. 실온에서 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한다.
세포를 1 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨 후, 다시 실온에서 5분 동안 500 g으로 원심분리하고, 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 버린다. 세포 표면 마커 염색을 수행하려면 세포를 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁하고, 각 표면 마커 항체의 2 마이크로리터를 각 튜브 내의 세포 현탁액에 첨가한다. 튜브를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
500g에서 5분 동안 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 제거한다. 다시, 세포를 PBS 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 버린다.
고정 및 막 파괴를 수행하려면 500 마이크로 리터의 막 파괴 고정 용액으로 세포를 재현탁하고 실온의 어두운 곳에서 20 분 동안 세포를 고정하십시오. 그 후 500g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한다. 세포를 1 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨 후, 실온에서 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 조심스럽게 제거하였다.
이어서, 세포를 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 세포내 사이토카인 염색을 위해 각각의 튜브 내의 세포 현탁액에 2 마이크로리터의 각 사이토카인 항체를 첨가한다. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 튜브를 배양하십시오. 다시, 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 제거한다.
다시 한번, 세포를 PBS 1 밀리리터에 재현 탁시킨다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 조심스럽게 제거한다. 그런 다음 500 마이크로리터의 PBS를 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.
PBMC 샘플을 단독으로, 이전에 입증된 바와 같이 단리한 후, 세포 현탁액을 원고에 기재된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에서 12등분으로 나눕니다. 유사하게, 세포 표면 마커 및 세포내 사이토카인 항체를 첨가한 후, 이전에 입증된 바와 같이, 500 마이크로리터의 PBS를 첨가하여 세포를 재부유시키고 저속으로 와동시킨다. 염색되지 않은 샘플을 사용하여 전방 산란, 측면 산란 및 다른 형광 염료 전압을 조정하고 단일 염색 샘플을 사용하여 서로 다른 형광단 사이의 오염 신호를 제거하기 위해 유세포 분석 보상을 조정합니다.
전방 산란 영역을 통해 다각형 게이트를 그리고, 측면 산란 영역을 통해 파편을 제외하고 온전한 림프구 집단을 선택하는 도트 플롯, 및 전방 산란 영역을 통해 직사각형 게이트를 그리며, 전방 산란 폭 도트 플롯을 통해 단일 세포를 선택하는 도트 플롯. 다음으로, 살아있는 사각 게이트를 통해 사각 게이트를 그리고, 살아있는 세포를 선택하는 데드 사이드 산점도 영역 도트 플롯을 통해 CD3 측면 산포 영역 도트 플롯을 통해 CD 3개의 양성 T 세포를 식별합니다. 그런 다음 CD4, CD8 도트 플롯을 통해 쿼드 게이트를 그려 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 식별하고 CD45RO, CD27 도트 플롯을 통해 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 TCM 및 TEM으로 세분화합니다.
CD8 양성 또는 CD4 양성 T 세포의 TCM 또는 TEM으로부터 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 2 및 마이크로파지 염증 단백질 중 하나의 알파를 그린 후 각각 다른 반응 패턴의 빈도를 확인하였다. 샘플을 세포분석에 순차적으로 로드합니다. 게이팅 전략은 전방 산란 영역 너비를 사용하여 CD8 양성 또는 CD4 양성 T 세포 및 그 하위 집합의 TCM 또는 TEM을 식별한 다음 측면 산란 영역 점도를 사용하여 사용되었습니다.
JEV에 대한 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 반응의 다기능적 특성화는 예방 접종을받지 않은 어린이의 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨 2의 증가 된 수준이 JEV 자극 후 예방 접종을받은 어린이의 CD8 양성 TCM 세포에서 검출되었음을 나타냅니다. 그러나, 대식세포 염증성 단백질의 알파 수준은 두 군 간에 차이가 없었다. 백신을 접종하지 않은 그룹과 비교하여 JEV 자극하에 백신 접종 그룹의 CD8 양성 TEM 세포에서 더 높은 수준의 CD107a 및 인터페론 감마가 검출되었습니다.
반면 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 2 및 대식세포 염증성 단백질 알파 1은 이들 양성 세포에서 유의하게 상승하지 않았다. JEV 항원은 백신을 접종하지 않은 그룹에 비해 백신을 접종한 그룹의 CD4 양성 TCM 세포에서 더 높은 수준의 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파 및 대식세포 염증 단백질 원 알파를 성공적으로 유도했습니다. 그러나, 인터루킨 2 양성 세포의 비율은 JEV 자극 하에서 두 그룹 간에 차이가 없었다.
백신접종군에서 CD107a 양성, 인터페론 감마 양성 및 종양 괴사 인자 알파 양성 서브세트, 서브 CD4 양성 TEM 세포의 비율은 백신접종되지 않은 군에서보다 JEV의 존재 하에서 더 높았다. 자극의 T 세포 면역원성과 호환 가능한 색상 일치 전략은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다.
