Il metodo di rilevamento e lo schema di colori della citometria a flusso del TPFS specifico del virus dell'encefalite giapponese sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili. La dimostrazione della procedura sarà eseguita da Linlin Zhang e Meng Zhang, due studenti del nostro laboratorio. Per iniziare, stimolare le PBMC del gruppo di stimolazione JEV con particelle JEV inattivate concentrate per 16 ore a 37 gradi Celsius in presenza di anticorpi monoclonali, CD28 e CD49d, CD107a, GolgiPlug e monensina.
Quindi, stimolare le PBMC del gruppo di controllo senza particelle virali concentrate per 16 ore a 37 gradi Celsius in presenza di anticorpi monoclonali, CD28 e CD49d, CD 107a, GolgiPlug e monensina. Raccogliere la sospensione cellulare da ciascun gruppo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante con una pipetta.
Risospendere le cellule in 1 millilitro di PBS. Aggiungere il colorante di vitalità fissabile alla sospensione cellulare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare a 500 g a temperatura ambiente per cinque minuti e rimuovere il surnatante.
Dopo aver risospeso le cellule in 1 millilitro di PBS, di nuovo, centrifugare a 500 g a temperatura ambiente per cinque minuti e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza. Per eseguire la colorazione dei marcatori della superficie cellulare, risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS e aggiungere due microlitri di ciascun anticorpo marcatore di superficie alla sospensione cellulare in ciascun tubo. Incubare i tubi per 30 minuti a temperatura ambiente proteggendoli dalla luce.
Centrifugare a 500 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante come dimostrato in precedenza. Ancora una volta, risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare accuratamente il surnatante .
Per eseguire la fissazione e la rottura della membrana, risospendere le cellule con 500 microlitri di soluzione fissativa che rompe la membrana e fissare le cellule per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. Quindi centrifugare a 500 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Dopo aver risospeso le cellule in un millilitro di PBS, centrifugare per cinque minuti a 500 g a temperatura ambiente e rimuovere accuratamente il surnatante come dimostrato in precedenza.
Quindi, risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS e aggiungere due microlitri di ciascun anticorpo citochina alla sospensione cellulare in ciascun tubo per la colorazione intracellulare delle citochine. Incubare i tubi per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Anche in questo caso, centrifugare a 500 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante come dimostrato in precedenza.
Ancora una volta, risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere accuratamente il surnatante come dimostrato in precedenza. Quindi, aggiungere 500 microlitri di PBS per risospendere le celle.
Dopo aver isolato il solo campione PBMC, come dimostrato in precedenza, dividere la sospensione cellulare in 12 parti uguali in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri descritte nel manoscritto. Allo stesso modo, dopo aver aggiunto i marcatori di superficie cellulare e l'anticorpo citochina intracellulare, come dimostrato in precedenza, aggiungere 500 microlitri di PBS per risospendere le cellule e il vortice a bassa velocità. Utilizzando un campione non colorato, regolare la dispersione diretta, la dispersione laterale e le diverse tensioni del colorante fluorescente, regolando la compensazione della citometria a flusso per eliminare i segnali di contaminazione tra i diversi fluorofori, utilizzando i singoli campioni di colorazione.
Disegnare un cancello poligonale attraverso l'area di dispersione in avanti, un dot plot dell'area di dispersione laterale per selezionare la popolazione di linfociti intatta, escludendo i detriti, e un cancello rettangolare attraverso l'area di dispersione in avanti, dot plot della larghezza di dispersione in avanti per selezionare le singole celle. Quindi, disegna un cancello rettangolare attraverso il dot plot dell'area di dispersione del lato morto vivo per selezionare le celle vive e un cancello rettangolare attraverso il grafico del punto dell'area di dispersione laterale CD3 per identificare le tre celle T positive del CD. Quindi, disegnare un quad gate attraverso il dot plot CD4, CD8 per identificare le cellule T CD4 positive o CD8 positive e attraverso il CD45RO, CD27 dot plot per suddividere le cellule T CD4 positive o CD8 positive in TCM e TEM.
Dopo aver disegnato le porte di CD107a, interferone gamma, fattore di necrosi tumorale alfa, interleuchina 2 e proteina infiammatoria microfagica uno alfa dal TCM o TEM delle cellule T CD8 positive o CD4 positive per determinare rispettivamente la frequenza dei diversi modelli di risposta. Caricare i campioni sulla citometria in sequenza. La strategia di gating è stata impiegata per identificare il TCM o TEM delle cellule T CD8 positive o CD4 positive e dei loro sottoinsiemi utilizzando la larghezza dell'area di dispersione diretta, quindi il dot plot dell'area di dispersione laterale.
La caratterizzazione polifunzionale delle risposte delle cellule T CD4 positive e CD8 positive alla JEV ha indicato che sono stati rilevati livelli aumentati di CD107a, interferone gamma, fattore di necrosi tumorale alfa e interleuchina 2 nelle cellule TCM CD8 positive dei bambini vaccinati dopo stimolazione JEV rispetto a quelli nei bambini non vaccinati. Tuttavia, il livello di proteina infiammatoria dei macrofagi uno alfa non differiva tra i due gruppi. Livelli più elevati di CD107a e interferone gamma sono stati rilevati nelle cellule TEM CD8 positive del gruppo vaccinato sotto stimolazione JEV rispetto al gruppo non vaccinato.
Mentre il fattore di necrosi tumorale alfa, l'interleuchina 2 e la proteina infiammatoria dei macrofagi uno alfa, non erano significativamente elevati in quelle cellule positive. L'antigene JEV ha indotto con successo livelli più elevati di CD107a, interferone gamma, fattore di necrosi tumorale alfa e proteina infiammatoria dei macrofagi uno alfa nelle cellule TCM CD4 positive del gruppo vaccinato rispetto al gruppo non vaccinato. Tuttavia, la proporzione di cellule positive all'interleuchina 2 non differiva tra i due gruppi sottoposti a stimolazione JEV.
La proporzione di sottogruppi CD107a positivi, interferone gamma positivi e fattore di necrosi tumorale alfa positivi, cellule TEM sub CD4 positive nel gruppo vaccinato era più alta in presenza di JEV, rispetto al gruppo non vaccinato. L'immunogenicità delle cellule T degli stimoli e le strategie di corrispondenza dei colori compatibili sono passaggi critici in questo protocollo.
