يمكن استخدام هذا البروتوكول لصياغة جسيمات نانوية دهنية متسقة تغلف MRA. يمكن ضبط معلمات الصياغة ويمكن تقييم الجسيمات النانوية الدهنية المختلفة من حيث قوتها وتوزيعها الحيوي. يمكن استخدام بروتوكول موحد لصياغة الجسيمات النانوية الدهنية والاختبار في المختبر وفي الجسم الحي لصياغة جسيمات نانوية دهنية متسقة يمكن مقارنتها مع بعضها البعض.
هناك الكثير من التفاصيل الصغيرة التي يجب وضعها في الاعتبار عند صياغة وتقييم فعالية الجسيمات النانوية ، ولكن ما هي التفاصيل التي تم حسابها؟ لا ينبغي أن يكون إعداد الصيغة صعبا. ابدأ بملء دورق نظيف سعة أربعة لترات ب 200 إلى 300 ملليلتر من 10X PBS الطازج ، وتخفيفه إلى 1X بماء فائق النقاء.
تأكد من أن الحجم النهائي ل PBS يتراوح بين 2 و 3 لترات. ضع أشرطة غسيل الكلى ذات السعة المناسبة للجسيمات النانوية الدهنية ، أو تركيبة LNP ، في دورق الحقل. قم بتخفيف عشرة أضعاف لمخزون احتياطي حمض الستريك 100 مللي مولار باستخدام ماء عالي النقاء لإنشاء مخزن مؤقت من حمض الستريك 10 مللي مولار لتخفيف mRNA.
بعد ذلك ، اصنع C 12 200 من الدهون المؤينة ، والدهون المساعدة ، والكوليسترول والدهون المثبتة في PEG أو حلول مخزون PEG الدهنية عن طريق إذابة كل دهون في إيثانول بنسبة 100٪. تأكد من إذابة محاليل المخزون بالكامل عن طريق تسخينها وخلطها عند 37 درجة مئوية. اجمع الأحجام المحسوبة لمكونات الليبيدات المختلفة في أنبوب مخروطي.
قم بتخفيف الدهون باستخدام 100٪ إيثانول إلى الحجم النهائي ل V ، والذي يمثل 25٪ من الحجم النهائي ل LNP. احسب كمية mRNA المطلوبة للتكوين بناء على نسبة وزن الدهون المؤينة إلى mRNA والحجم الكلي ل mRNA-LNP. بعد ذلك ، قم بإذابة اليراع لوسيفيراز الذي يشفر mRNA على الجليد.
ثم قم بتخفيف mRNA إلى الحجم النهائي ثلاث مرات المرحلة العضوية باستخدام المخزن المؤقت لحمض الستريك 10 مللي مولار. رش مسح مهمة دقيق بتطهير سطح للحمض النووي الريبي والحمض النووي ، وامسح الجزء الداخلي من أداة الموائع الدقيقة جيدا. بعد ذلك ، افتح خرطوشة ميكروفلويديك جديدة وأدخلها مع توجيه قنوات المدخل لأسفل وبعيدا.
رتب أنبوبين مخروطيين معقمين سعة 15 ملليلتر على الحامل مع إزالة الأغطية. بمجرد الانتهاء من ذلك ، املأ حقنة سعة خمسة ملليلتر بمحلول mRNA الذي يحتوي على mRNA المخفف في محلول حمض الستريك 10 مليمولار. ثم املأ حقنة ثلاثة ملليلتر بمحلول دهني يحتوي على الدهون المخففة في الإيثانول بنسبة 100٪.
تأكد من إزالة أي هواء من المحاقن. ثم بدون الإبرة ، أدخل المحقنة سعة خمسة ملليلتر التي تحتوي على محلول mRNA في المدخل الأيسر للخرطوشة ، وأدخل المحقنة الثلاثة ملليلتر التي تحتوي على محلول الدهون في المدخل الأيمن للخرطوشة. قم بتشغيل أداة الموائع الدقيقة وحدد التشغيل السريع.
بعد اختيار أنواع المحاقن الصحيحة للمحاقن الخمسة والثلاثة ملليلتر التي تم إدخالها ، أدخل معلمات صياغة LNP بنسبة ثلاثة إلى واحد من معدل التدفق المائي إلى العضوي ، قبل الضغط على زر البدء لصياغة mRNA-LNPs. قم بتحميل mRNA-LNPs التي تم جمعها في الأنبوب المخروطي الأيمن في أشرطة غسيل الكلى التي تم ترطيبها مسبقا باستخدام حقنة دون ثقب أو لمس غشاء الكاسيت ، ضع أشرطة غسيل الكلى التي تحتوي على mRNA-LNPs مرة أخرى في الدورق الذي يحتوي على PBS واتركها لغسيل الكلى لمدة ساعتين على الأقل. بعد غسيل الكلى ، أحضر أشرطة غسيل الكلى التي تحتوي على mRNA-LNPs في خزانة معقمة للسلامة البيولوجية وقم بإزالة mRNA-LNPs باستخدام حقنة بإبرة.
قم بتصفية mRNA-LNPs المعقمة باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر وجمعها في أنبوب مخروطي معقم. ثم ضع 65 ميكرولترا من محلول mRNA-LNP في أنبوب دقيق سعة 1.5 ملليلتر للتوصيف. لوحة 5،000 خلية HepG2 في جدار أبيض ، قاع شفاف ، صفيحة 96 بئر في 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الكامل واحتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة خاضعة للرقابة عند 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
قبل معالجة الخلايا باستخدام mRNA-LNPs ، قم بإزالة الوسط الكامل من الآبار. بعد ذلك ، عالج الخلايا إما ب 100 ميكرولتر من mRNA-LNPs المخففة في وسط زراعة الخلايا الكامل بالجرعات المطلوبة ، أو 100 ميكرولتر من الوسط الكامل قبل الحضانة لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من لوحة 96 بئرا ، أضف 20 ميكرولترا من محلول التحلل إلى كل بئر متبوعا ب 100 ميكرولتر من كواشف فحص لوسيفيراز.
احم اللوحة من الضوء وضع اللوحة في قارئ لوحة لقياس إشارة التوهج الحيوي. تمييع محلول mRNA-LNP باستخدام برنامج تلفزيوني معقم بحيث يوجد ميكروغرام من إجمالي mRNA في 100 ميكرولتر من حجم حقن الوريد الذيل. املأ حقنة أنسولين قياس 29 إما ب 100 ميكرولتر من mRNA-LNP أو 100 ميكرولتر من PBS وقم بإزالة أي فقاعات من المحقنة.
أدخل الإبرة بحيث يكون الشطبة متجهة لأعلى في وريد الذيل الجانبي للفأر وقم ببطء بحقن 100 ميكرولتر من mRNA-LNP أو PBS. بعد ست ساعات من الحقن ، قم بإعداد محلول مخزون 15 ملليغرام لكل ملليلتر من ملح البوتاسيوم D-Luciferin في برنامج تلفزيوني معقم. في برنامج التصوير لنظام التصوير في الجسم الحي ، أو IVIS ، حدد المربع بجوار التلألؤ قبل الضغط على تهيئة لإعداد الجهاز للحصول على البيانات.
بعد ذلك ، قم بإعطاء 200 ميكرولتر من D-Luciferin داخل الصفاق للفئران المعالجة سابقا وانتظر لمدة 10 دقائق بينما تستقر إشارة luciferase قبل تخدير الفئران. انقل الفئران المخدرة إلى مخاريط الأنف داخل نظام التصوير في الجسم الحي ، وتأكد من أنها على ظهورها مع كشف بطونها ، قبل إغلاق باب الغرفة. في برنامج التصوير ، تأكد من تحديد مجال الرؤية الصحيح واضبط وقت التعرض على تلقائي ، انقر فوق زر الاكتساب في البرنامج للحصول على صور التلألؤ الحيوي.
تم تحديد كفاءة التغليف ل mRNA-LNPs بنسبة 92.3٪ باستخدام مقايسة التألق المعدلة والمعادلة الموضحة هنا. لوحظ زيادة التلألؤ الحيوي عند علاج 5،000 خلية HepG2 بجرعات متزايدة من mRNA-LNP. تم اكتشاف تعبير لوسيفيراز بسهولة عند أقل جرعة لهذه الدراسة تبلغ خمسة نانوجرام لكل بئر.
لوحظت إشارة تلألؤ حيوي قوية في الجزء العلوي من بطن الفئران المعالجة ب LNPs المصاغة. تم رسم مناطق الاهتمام حول إشارات الكبد لحساب التدفق الكلي للإنارة. كان إجمالي تدفق الإنارة حوالي خمسة في 10 إلى 9.
حافظ دائما على نسبة الدهون المؤينة إلى وزن الحمض النووي عند صياغة LNPs. يجب أن يحتوي كل حجم من الطور العضوي على دهون مؤينة تقابل mRNA في ثلاثة مجلدات من الطور المائي.
