이 프로토콜은 MRA를 캡슐화하는 일관된 지질 나노 입자를 제형화하는 데 사용할 수 있습니다. 제형 파라미터를 조정할 수 있으며 다양한 지질 나노입자의 효능 및 생체내 분포를 평가할 수 있습니다. 지질 나노입자 제형과 시험관 내 및 생체 내 테스트를 위한 표준화된 프로토콜을 사용하여 서로 비교할 수 있는 일관된 지질 나노입자를 제형화할 수 있습니다.
나노 입자 효능을 공식화하고 평가할 때 명심해야 할 작은 세부 사항이 많이 있지만 어떤 세부 사항을 설명합니까? 제형을 준비하는 것은 어렵지 않아야합니다. 깨끗한 4리터 비커에 200-300밀리리터의 신선한 10X PBS를 채우고 초순수로 1X로 희석하는 것으로 시작합니다.
PBS의 최종 부피가 2리터에서 3리터 사이인지 확인하십시오. 지질 나노입자 또는 LNP 제형에 적합한 용량의 투석 카세트를 필드 비커에 넣습니다. mRNA 희석을 위한 10m몰 구연산 완충액을 만들기 위해 초순수를 사용하여 100mcal 구연산 완충액을 10배 희석합니다.
다음으로, 각 지질을 100% 에탄올에 용해시켜 C12200 이온화 가능한 지질, 보조 지질, 콜레스테롤 및 지질 고정 PEG 또는 지질 PEG 원액을 제조합니다. 원액이 섭씨 37도에서 가열하고 혼합하여 완전히 용해되었는지 확인합니다. 서로 다른 지질 성분의 계산된 부피를 원뿔형 튜브에 결합합니다.
지질을 100% 에탄올로 희석하여 LNP 최종 부피의 25%를 나타내는 V의 최종 부피로 묽게 합니다. 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량 비율과 mRNA-LNP의 총 부피를 기반으로 제형에 필요한 mRNA의 양을 계산합니다. 다음으로, mRNA를 암호화하는 반딧불이 루시페라아제를 얼음 위에서 해동합니다.
그런 다음 10 밀리몰 구연산 완충액을 사용하여 mRNA를 유기상의 3 배로 최종 부피로 희석합니다. RNA 및 DNA에 대한 표면 오염 제거제를 섬세한 작업 와이프에 뿌리고 미세유체 기기 내부를 철저히 닦습니다. 그런 다음 새 미세유체 카트리지를 열고 입구 채널이 아래를 향하도록 삽입합니다.
캡을 닫은 상태에서 홀더에 두 개의 멸균 15밀리리터 원뿔형 튜브를 배치합니다. 완료되면 10밀리몰 구연산 완충액에 희석된 mRNA가 포함된 mRNA 용액으로 5밀리리터 주사기를 채웁니다. 그런 다음 100% 에탄올에 희석된 지질이 포함된 지질 용액으로 3밀리리터 주사기를 채웁니다.
주사기에서 공기를 제거해야 합니다. 그런 다음 바늘 없이 mRNA 용액이 포함된 5밀리리터 주사기를 카트리지의 왼쪽 입구에 삽입하고 지질 용액이 포함된 3밀리리터 주사기를 카트리지의 오른쪽 입구에 삽입합니다. 미세유체 기기를 켜고 빠른 실행을 선택합니다.
삽입된 5mL 및 3mL 시린지에 대한 올바른 시린지 유형을 선택한 후 시작 버튼을 눌러 mRNA-LNP를 포뮬레이션하기 전에 3:1 수용성 대 유기 유속 비율로 LNP 제형에 대한 파라미터를 입력합니다. 오른쪽 원뿔형 튜브에 수집된 mRNA-LNP를 카세트 멤브레인에 구멍을 뚫거나 건드리지 않고 주사기를 사용하여 이전에 수화된 투석 카세트에 로드하고, mRNA-LNP가 포함된 투석 카세트를 PBS가 들어 있는 비커에 다시 넣고 최소 2시간 동안 투석합니다. 투석 후 mRNA-LNP가 포함된 투석 카세트를 멸균 생물안전 캐비닛으로 가져오고 바늘이 있는 주사기를 사용하여 mRNA-LNP를 제거합니다.
0.22마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 mRNA-LNP를 멸균 여과하고 멸균 원뿔형 튜브에 수집합니다. 그런 다음 특성 분석을 위해 65 마이크로리터의 mRNA-LNP 용액을 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 넣습니다. 플레이트 5, 000 HepG2 세포를 흰색 벽, 명확한 바닥, 완전한 세포 배양 배지의 100 마이크로 리터에 96 웰 플레이트하고 5 % 이산화탄소를 포함하는 섭씨 37도에서 제어 된 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.
mRNA-LNP로 세포를 처리하기 전에 웰에서 전체 배지를 제거합니다. 다음으로, 원하는 용량으로 완전한 세포 배양 배지에 희석된 100마이크로리터의 mRNA-LNP 또는 24시간 배양 전에 100마이크로리터의 완전한 배지로 세포를 처리합니다. 배양 후 96웰 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거하고 각 웰에 20마이크로리터의 용해 완충액을 첨가한 다음 100마이크로리터의 루시페라아제 분석 시약을 추가합니다.
플레이트를 빛으로부터 보호하고 플레이트를 플레이트 리더에 넣어 생물 발광 신호를 측정합니다. 멸균 PBS를 사용하여 mRNA-LNP 용액을 희석하여 총 mRNA 2마이크로그램이 꼬리 정맥 주입 부피 100마이크로리터에 존재하도록 합니다. 29게이지 인슐린 주사기에 100마이크로리터의 mRNA-LNP 또는 100마이크로리터의 PBS를 채우고 주사기에서 기포를 제거합니다.
비스듬한 방향이 위를 향하도록 바늘을 쥐의 측면 꼬리 정맥에 삽입하고 100마이크로리터의 mRNA-LNP 또는 PBS를 천천히 주입합니다. 주사 후 6시간 후, 멸균 PBS에서 D-루시페린 칼륨염의 밀리리터당 15밀리그램 원액을 준비합니다. in vivo 이미징 시스템(IVIS)용 이미징 소프트웨어에서 초기화를 누르기 전에 발광 옆에 있는 상자를 선택하여 기기 데이터 수집을 준비합니다.
다음으로, 이전에 치료한 마우스에 200마이크로리터의 D-루시페린을 복강내로 투여하고 루시페라아제 신호가 안정화되는 동안 10분 동안 기다렸다가 마우스를 마취합니다. 마취된 쥐를 생체 내 이미징 시스템 내부의 코뿔로 옮겨 챔버 도어를 닫기 전에 복부가 노출된 상태로 등을 대고 있는지 확인합니다. 이미징 소프트웨어에서 올바른 시야가 선택되었는지 확인하고 노출 시간을 자동으로 설정하고 소프트웨어에서 획득 버튼을 클릭하여 생물 발광 이미지를 얻습니다.
mRNA-LNP의 캡슐화 효율은 여기에 표시된 수정된 형광 분석 및 방정식을 사용하여 92.3%로 측정되었습니다. 증가 bioluminescence는 5의 처리에, mRNA-LNP의 증가 복용량을 가진 000의 HepG2 세포에 관찰되었다. 루시페라아제 발현은 웰당 5나노그램의 이 연구의 가장 낮은 용량에서 쉽게 검출되었습니다.
강력한 생물 발광 신호는 공식화 된 LNP로 처리 된 마우스의 상복부에서 관찰되었습니다. 총 발광 플럭스를 계산하기 위해 간 신호 주위에 관심 영역을 그렸습니다. 총 발광속은 9 일까지 약 5 배 10이었습니다.
LNP를 제형화할 때 항상 이온화 가능한 지질 대 핵산 중량비를 유지하십시오. 유기상의 모든 부피는 수성상의 3개 부피에서 mRNA에 해당하는 이온화 가능한 지질을 포함해야 합니다.
