このプロトコルがMRAを内包する一貫した脂質のナノ粒子を作り出すのに使用することができる。製剤パラメータを調整し、さまざまな脂質ナノ粒子の効力と生体内分布を評価できます。脂質ナノ粒子の調製、in vitroおよびin vivo試験のための標準化されたプロトコルを使用して、互いに比較できる一貫した脂質ナノ粒子を調製することができます。
ナノ粒子の効力を調合・評価する際には、留意すべき細かい点がたくさんありますが、どの点が考慮されたのでしょうか?製剤の調製は難しくないはずです。まず、清潔な4リットルのビーカーに200〜300ミリリットルの新鮮な10X PBSを充填し、超純水で1倍に希釈します。
PBSの最終容量が2〜3リットルであることを確認してください。脂質ナノ粒子またはLNP製剤に適した容量の透析カセットをフィールドビーカーに入れます。超純水を使用して100ミリモルのクエン酸緩衝液を10倍希釈し、mRNA希釈用の10ミリモルのクエン酸緩衝液を作成します。
次に、各脂質を100%エタノールに溶解して、C 12 200イオン化脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、脂質アンカーPEGまたは脂質PEGストック溶液を作製します。原液を37°Cで加熱混合し、完全に溶解していることを確認します。異なる脂質成分の計算された体積を円錐形のチューブに組み合わせます。
脂質を100%エタノールで希釈し、最終容量V(LNPの最終容量の25%)に希釈します。イオン化脂質とmRNAの重量比とmRNA-LNPの総量から、製剤化に必要なmRNAの量を算出します。次に、mRNAをコードするホタルルシフェラーゼを氷上で解凍します。
次に、10 mmモルのクエン酸バッファーを使用して、mRNA を最終容量の有機相の 3 倍に希釈します。デリケートなタスクワイプにRNAとDNAの表面除染剤をスプレーし、マイクロ流体機器の内部を完全に拭きます。次に、新しいマイクロ流体カートリッジを開き、インレットチャネルを下に向けて反対側に挿入します。
キャップを外した状態で、ホルダーに滅菌済みの15ミリリットルのコニカルチューブを2本配置します。完了したら、10ミリモルのクエン酸緩衝液で希釈したmRNAを含むmRNA溶液を5ミリリットルのシリンジに充填します。次に、100%エタノールで希釈した脂質を含む脂質溶液を3ミリリットルのシリンジに充填します。
シリンジから空気を抜いてください。次に、針を使わずに、mRNA溶液の入った5ミリリットルのシリンジをカートリッジの左入口に挿入し、脂質溶液の入った3ミリリットルのシリンジをカートリッジの右入口に挿入します。マイクロ流体装置の電源を入れ、クイックランを選択します。
挿入した5ミリリットルおよび3ミリリットルのシリンジに適切なシリンジタイプを選択した後、LNP調合のパラメータを水と有機物の流量比で3対1で入力してから、スタートボタンを押してmRNA-LNPを調製します。右の円錐形チューブに採取したmRNA-LNPを、カセットメンブレンに穴を開けたり触れたりすることなく、シリンジであらかじめ水和した透析カセットにセットし、mRNA-LNPの入った透析カセットをPBSの入ったビーカーに戻し、2時間以上透析します。透析後、mRNA-LNPを含む透析カセットを滅菌バイオセーフティキャビネットに入れ、針付きシリンジを使用してmRNA-LNPを取り除きます。
0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してmRNA-LNPを滅菌ろ過し、滅菌コニカルチューブに回収します。次に、65マイクロリットルのmRNA-LNP溶液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れて特性評価します。5、000 HepG2細胞を白い壁、透明な底、96ウェルプレートに100マイクロリットルの完全な細胞培養培地にプレートし、5%の二酸化炭素を含む37°Cの制御されたインキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。
細胞をmRNA-LNPで処理する前に、ウェルから完全な培地を除去します。次に、100マイクロリットルのmRNA-LNPを完全な細胞培養培地で所望の用量で希釈するか、24時間のインキュベーションの前に100マイクロリットルの完全な培地で細胞を処理します。インキュベーション後、96ウェルプレートから細胞培養培地を取り出し、各ウェルに20マイクロリットルの溶解緩衝液を加え、続いて100マイクロリットルのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加します。
プレートを光から保護し、プレートをプレートリーダーに入れて生物発光シグナルを測定します。滅菌PBSを用いてmRNA-LNP溶液を希釈し、尾静脈注入量100マイクロリットル中に2マイクログラムの総mRNAが存在するようにします。29ゲージのインスリンシリンジに100マイクロリットルのmRNA-LNPまたは100マイクロリットルのPBSを充填し、シリンジから気泡を取り除きます。
斜角を上に向けて針をマウスの側尾静脈に挿入し、100マイクロリットルのmRNA-LNPまたはPBSをゆっくりと注入します。注射の6時間後に、滅菌PBS中のD-ルシフェリンカリウム塩の15ミリグラム/ミリリットルのストック溶液を調製します。in vivo イメージングシステム(IVIS)用のイメージングソフトウェアで、発光の横のボックスを選択してから初期化を押して、データ取得用の装置を準備します。
次に、以前に治療したマウスに200マイクロリットルのD-ルシフェリンを腹腔内に投与し、ルシフェラーゼシグナルが安定するまで10分間待ってからマウスに麻酔をかけます。麻酔をかけたマウスをin vivoイメージングシステム内のノーズコーンに移し、腹部を露出させて仰向けになったことを確認してから、チャンバーのドアを閉めます。イメージングソフトウェアで、正しい視野が選択されていることを確認し、露光時間を自動に設定し、ソフトウェアの取得ボタンをクリックして生物発光画像を取得します。
mRNA-LNPのカプセル化効率は、ここに示した修飾蛍光アッセイと式を用いて92.3%と決定しました。5, 000 個の HepG2 細胞を mRNA-LNP の用量を増やして処理すると、生物発光の増加が観察されました。ルシフェラーゼの発現は、この研究の最低用量であるウェルあたり5ナノグラムで容易に検出されました。
調製LNPで処理したマウスの上腹部に強い生物発光シグナルが観察され、肝臓シグナルの周囲に関心のある領域を描画して、総発光フラックスを計算しました。全発光束は10倍から約5倍から9倍であった。
LNPを調製する際には、イオン化可能な脂質と核酸の重量比を常に維持してください。有機相の各容量には、水相の 3 容量の mRNA に対応するイオン化脂質が含まれている必要があります。
