يمكن استخدام المصفوفة خارج الخلية أو الجسيمات الدقيقة الهيدروجيل الرقمية ECM كوحدات بناء لتصنيع السقالات. يوضح هذا البروتوكول التصنيع والتنقية والتجفيد وتجميع الصور والطباعة الحيوية 3D للجسيمات الدقيقة للجيلاتين ميثاكريلويل أو الجسيمات الدقيقة هيدروجيل GelMA. GelMA عبارة عن بوليمر حيوي كيميائي ضوئي وقابل للتشابك وقائم على البروتين يحتوي على مادة لاصقة للخلايا وأجزاء قابلة للتحلل الحيوي والتي تم استخدامها على نطاق واسع كمادة حيوية مستجيبة للخلايا ومفيدة.
بالمقارنة مع هيدروجيل السائب التقليدي ، فإن سقالات هيدروجيل الحبيبية GelMA صغيرة المسامية ، مما يتيح تسلل سريع للخلايا يمكن تخصيصه حسب حجم كتلة البناء. قد تفتح سقالات هيدروجيل الحبيبية GelMA فرصا جديدة للطباعة الحيوية 3D للأنسجة السميكة والأعضاء والأمراض على منصات رخيصة وهندسة متجددة. للبدء ، أضف 10 ملليغرام من LAP إلى 10 ملليلتر من DPBS لتحضير محلول بادئ ضوئي بنسبة 0.1٪.
احم المحلول من الضوء عن طريق لفه بورق الألمنيوم وتسميته. بعد ذلك ، قم بإذابة الكمية المطلوبة من GelMA في محلول البادئ الضوئي. ضع المحلول المغلف بورق الألمنيوم في فرن 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للحصول على محلول واضح.
لتحضير مرحلة الزيت ، اصنع محلول خافض للتوتر السطحي متوافق حيويا بنسبة 2٪ في السائل الهندسي. أدخل أنبوب Tygon في مداخل ومخرج جهاز PDMS ، ثم أدخل إبرة حادة قياس 25 في الطرف الآخر من أنابيب Tygon للمداخل. ضع الجهاز تحت المجهر ، وحافظ على دفء البيئة عند حوالي 40 درجة مئوية باستخدام مجفف شعر أو سخان فضاء.
قم بتحميل المحاليل المائية والزيتية في محاقن منفصلة متصلة بالجهاز. ابدأ تشغيل مضخة المحقنة لمرحلة الزيت بمعدل تدفق 160 ميكرولتر في الدقيقة. بعد أن يملأ الزيت القناة ، ابدأ المرحلة المائية عند 80 ميكرولتر في الدقيقة.
تحقق من تكوين القطيرات تحت المجهر. اجمع القطرات في حاوية ، وقم بتقييمها في غرفة التصوير عن طريق التصوير المجهري الضوئي. احتفظ بالقطرات عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع حمايتها من الضوء لبدء التشابك المادي ل GelMA microgel وتحويل القطرات إلى كبسولات هلامية مستقرة.
لتنفيذ طريقة MEtoP من مستحلب إلى مسحوق ، قم بجمع المواد الهلامية المتشابكة ماديا في السائل الهندسي باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة متينة حراريا أو cryovials. أغلق الأنبوب المفتوح بمسح وشريط مختبري. قم بتجميد الهلام المتشابك جسديا في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق للمضي قدما في التجفيد.
بعد التجفيد ، سيتم الحصول على مسحوق صلب. أضف ملليلتر واحد من محلول البادئ الضوئي المبرد بنسبة 0.1٪ عند أربع درجات مئوية إلى المسحوق المجفف بالتجميد لعمل معلقات ميكروجيل. أجهزة الطرد المركزي الخليط الدوامي في 3،000g لمدة 15 ثانية.
بعد التخلص من المادة الطافية ، انقل تعليق الميكروجيل المعبأ إلى قالب باستخدام ماصة إزاحة موجبة ، وقم بتعريضه للضوء بطول موجي 400 نانومتر بكثافة 15 مللي واط لكل سنتيمتر مربع لمدة 60 ثانية لتشكيل سقالات هيدروجيل حبيبية أو GHS. بالنسبة ل 400 ميكرولتر من معلق الميكروجيل ، أضف كمية متساوية من محلول PFO المثلج البارد ، 20٪ في السائل الهندسي إلى الهلاميات الدقيقة GelMA المتشابكة جسديا. ثم قم بطرد الخليط الدوامي عند 300 جرام لمدة 15 ثانية ، وقم بإزالة مرحلة الزيت من الهلاميات الدقيقة GelMA عن طريق الماصة.
ثم أضف 400 ميكرولتر من محلول المثلج البارد ، 0.1٪ ضوئي إلى تعليق microgel. بعد الطرد المركزي للمحلول الدوامي عند 300 جرام لمدة 15 ثانية ، تخلص من الزيت. كرر خطوات إضافة محلول البادئ الضوئي والطرد المركزي ، ولكن الطرد المركزي عند 3،000 جرام هذه المرة وتخلص من المادة الطافية للهلام الدقيق GelMA المعبأ.
انقل المواد الهلامية الدقيقة GelMA المعبأة إلى قالب ، متبوعا بالتعرض للضوء لتشكيل GHS. أضف 100 ملليغرام من مسحوق الصفائح الدموية النانوية إلى ثلاثة ملليلتر من الماء المثلج النقي للغاية لتشكيل تشتت الجسيمات النانوية بنسبة 3.33٪. دوامة التشتت بقوة داخل ثلاجة أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لتقشير الجسيمات النانوية المجمعة.
تنتج الجسيمات النانوية المقشرة بشكل صحيح تشتتا واضحا. قم بإذابة 50 ملليغرام من LAP في خمسة ملليلتر من الماء المثلج عالي النقاء لتحضير محلول مخزون ضوئي بنسبة 1٪. ثم أضف 333 ميكرولترا من محلول بادئ ضوئي 1٪ إلى تشتت الجسيمات النانوية المقشرة ، ولفها بورق الألمنيوم للحماية من الضوء المحيط.
دوامة الخليط لمدة دقيقة واحدة لخلط تشتت الجسيمات النانوية والبادئ الضوئي. أضف PFO المثلج البارد ، 20٪ في السائل الهندسي إلى الهلاميات الدقيقة GelMA المتشابكة جسديا بنسبة حجم واحد إلى واحد. بعد الطرد المركزي للخليط الدوامي عند 300 جرام لمدة 15 ثانية ، تخلص من مرحلة الزيت التي تحتوي على الفاعل بالسطح.
أضف تشتت الجسيمات النانوية الباردة المكملة ب LAP إلى الهلاميات الدقيقة GelMA المغسولة. بعد الطرد المركزي عند 3،000 جرام لمدة 15 ثانية ، تخلص من الزيت المتبقي في القاع وتشتت المادة الطافية. قم بتخزين التعليق عند أربع درجات مئوية مع حمايته من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم لمدة يوم واحد لإنتاج المنتج GelMA الحبر الحيوي الحبيبي النانوي أو NGB.
في اليوم التالي ، قم بتحميل NGB في حقنة سعة ثلاثة ملليلترات. أغلق المحقنة المحملة بغطاء وبارافيلم ، وقم بالطرد المركزي النبضي عند 200 جرام لإزالة الهواء المحبوس. انقل الحبر الحيوي إلى خرطوشة سعة ثلاثة ملليلتر باستخدام موصل قفل Luer أنثى أنثى.
قم بطرد الخرطوشة لفترة وجيزة عند 200 جرام مرة أخرى لإزالة الهواء المحبوس ، والحفاظ على NGB عند أربع درجات مئوية قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بتحميل تعليق خلية الخلايا الليفية للفأرة المحضرة في حقنة سعة ثلاثة ملليلترات. قم بإقران NGB والمحاقن المحملة بالخلايا باستخدام موصل قفل Luer للإناث والإناث ، وامزج المحتويات برفق عن طريق الدفع ذهابا وإيابا 40 مرة.
اطبع NGB أو NGB المحمل بالخلايا باستخدام طابعة حيوية مناسبة مع فوهة مخروطية قياسية عن طريق تحميل الفوهة في رأس الطباعة سعة ثلاثة ملليلترات. حافظ على درجة حرارة قاعدة الطباعة أقل من 10 درجات مئوية ، وقم بتحسين المعلمات مثل السرعة والضغط الخلفي. حدد ملف gcode أو STL المرغوب فيه.
ثم حدد الركيزة ونوع الفوهة لحقنة هوائية سعة ثلاثة ملليلتر مزودة بفوهة مخروطية قياسية. قم بمعايرة الطابعة الحيوية باستخدام إرشادات الجهاز ، وابدأ الطباعة للحصول على هياكل 3D. أنتجت تقنية MEtoP مسحوق ميكروجل مجفف قابل لإعادة الامتصاص عن طريق التجفيف بالتجميد بالضغط المنخفض مع حماية الهلاميات الدقيقة من التجميع والتشوه الشديد.
أظهرت صور SEM أن الجسيمات الدقيقة GelMA المجففة باستخدام هذه التقنية تحتفظ بشكلها الكروي بعد التجفيد مقارنة بالتجميع الذي لوحظ مع التجفيد التقليدي. أظهر توصيف المسام الدقيقة ل GelMA و GHS و NGB مع صبغة مضان عالية الوزن الجزيئي مساحات الفراغ المجهرية المترابطة. أيضا ، اكتشفت الصورة الفلورية التي تم تقييمها باستخدام برنامج نصي MATLAB مكتوب خصيصا المسام.
لم تظهر قياسات القطر المكافئ للجزء الفراغي ومتوسط المسام أي فرق كبير يشهد على توفر وربط المسام المجهرية في السقالات المطبوعة 3D باستخدام NGB. كشف تفوق سقالات NGB على الهلاميات الدقيقة GelMA المعبأة بإحكام وفضفاضة من خلال قياس طول الفتيل المعلق أن NGB كان له طول أكبر من الهلاميات الدقيقة المعبأة. لم تسفر الهلاميات الدقيقة المعبأة بشكل فضفاض عن خيوط.
كانت الأسطوانة المجوفة مطبوعة بتقنية 3D ، وتعرض البناء بأكمله للضوء من أجل الربط الضوئي. تم الاحتفاظ بالهيكل المطبوع فعليا لإظهار الشكل والإخلاص والسلامة الهيكلية. إذا تم استخدام السقالة للتقييم البيولوجي ، على سبيل المثال ، في الطباعة الحيوية المحملة بالخلايا ، تذكر تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معينة ، تحت خزانة السلامة البيولوجية.
نأمل في إلغاء تسويق استخدام سقالات الهيدروجيل الحبيبية كمنصة للمواد الحيوية الناشئة حديثا في الطب الحيوي.
