يقوم مكتب مختبرات العلوم والهندسة في إدارة الغذاء والدواء بتطوير أدوات العلوم التنظيمية لمساعدة مطوري الأجهزة الطبية ومراجعي إدارة الغذاء والدواء. هدفنا النهائي هو تسريع وصول المرضى إلى الأجهزة الطبية المبتكرة والآمنة والفعالة من خلال أفضل العلوم المتاحة. في هذا البروتوكول ، نطبق أحدث تقنيات الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لتقييم الأجهزة الطبية المستخدمة لعلاج أمراض القلب التي تهدد الحياة.
تتيح هذه الأداة البسيطة إجراء تقييم قابل للتكرار لأجهزة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب في الطبق باستخدام معدات المختبرات القياسية. يمكن استخدامه أيضا مع الخلايا الخاصة بالمريض المشتقة من المتبرعين المصابين بأمراض القلب المختلفة. للبدء ، قم بطلاء خلايا عضلة القلب البشرية المذابة iPSC المشتقة على 0.1٪ من ألواح الآبار المعقمة المغلفة بالجيلاتين قبل يومين على الأقل من بذر خلايا عضلة القلب على ركيزة الهيدروجيل المرنة.
استزراع الخلايا العضلية القلبية البشرية المستمدة من iPSC في وسط عضلة القلب القياسي لمدة يومين إلى أربعة أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح لهم بالتعافي من الحفظ بالتبريد. قم بتحديث الوسط المستهلك باستخدام وسط عضلة القلب بنسبة 100٪ كل 48 ساعة. تحقق من حالة الخلايا العضلية القلبية البشرية المشتقة من iPSC قبل التفكك من خلال تقييم صحة الخلايا ، وضمان الصلاحية والضرب المستقر.
اغسل خلايا عضلة القلب بأربعة ملليلتر لكل بئر من DPBS بدون كلوريد الكالسيوم أو كلوريد المغنيسيوم. أضف ملليلتر واحد من كاشف تفكك درجة حرارة الغرفة إلى كل بئر واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من وسط عضلة القلب إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر.
افصل الخلايا العضلية القلبية عن الألواح ذات الستة آبار باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر وأضف تعليق الخلية إلى الأنبوب المخروطي. شطف الآبار مع ملليلتر واحد من وسط عضلة القلب الطازجة لجمع أي خلايا عضلة القلب المتبقية وإضافتها إلى الأنبوب المخروطي. ثم أحضر الحجم النهائي للأنبوب المخروطي إلى 15 ملليلتر مع الوسيط.
جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 جرام لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية حتى علامة ملليلتر واحد. أعد تعليق الخلايا في وسط عضلة القلب إلى حجم نهائي يبلغ خمسة ملليلتر وعد الخلايا العضلية القلبية باستخدام عداد خلايا يدوي أو آلي. بعد ذلك ، احتضان تعليق خلية عضلة القلب لمدة 30 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة بينما يتم تحضير ركائز الهيدروجيل المرنة.
جهز ماصة سعة 20 ميكرولتر مثبتة في ميكرولتر واحد ، وأطراف ماصة ، ولوحة سفلية زجاجية معقمة من 48 بئرا ، ومؤقت ساعة توقيت في غطاء زراعة الأنسجة. امزج المصفوفة خارج الخلية أو ركيزة هيدروجيل القائمة على ECM عن طريق النقر برفق على الأنبوب ووضعه على الفور مرة أخرى على الجليد. ابدأ مؤقت ساعة الإيقاف مباشرة قبل طلاء ركيزة الهيدروجيل الأولى وحدد هذا على أنه الوقت صفر.
ماصة ميكرولتر واحد من ركيزة هيدروجيل لأعلى ولأسفل ثلاث مرات تقريبا لتبريد طرف الماصة. ثم ضع ما يقرب من ميكرولتر واحد من ركيزة الهيدروجيل غير المخففة أفقيا على قاع كل بئر في لوحة 48 بئرا ، مع الاحتفاظ بالماصة بزاوية 45 درجة. ضع جميع ركائز الهيدروجيل في نفس الاتجاه في كل بئر للمساعدة في تحديد الركيزة عند إجراء التجارب عند تكبير 40X.
ضع الغطاء على لوحة 48 بئرا واترك ركائز الهيدروجيل تحضن لمدة ثماني إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة قبل إضافة الخلايا. بعد الحضانة ، قم على الفور بزرع خلايا عضلة القلب بالتنقيط مباشرة على ركائز هيدروجيل مع ما يقرب من 30،000 خلية عضلية قلبية قابلة للحياة لكل بئر في حجم متوسط منخفض يبلغ حوالي 200 ميكرولتر من وسط عضلة القلب. بعد إغلاق الغطاء ، اسمح لخلايا عضلة القلب بالاحتضان دون عائق لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الغطاء لتمكين الخلايا من الالتصاق بركيزة الهيدروجيل.
أضف بلطف 100 ميكرولتر من وسط عضلة القلب الطازج إلى كل بئر. ضع الغطاء المغلق على حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى أربعة أيام. قم بتشغيل المجهر وغرفة التحكم البيئي لتحقيق التوازن إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
قم بإزالة وسط عضلة القلب من اللوحة المكونة من 48 بئرا وشطف كل بئر برفق مرتين باستخدام 600 ميكرولتر من تعديل انقباض القلب أو وسيط فحص CCM. ثم أضف 300 ميكرولتر من وسط فحص CCM لكل بئر وضع لوحة 48 بئرا على المجهر في غرفة التحكم البيئي. أدخل الأقطاب الكهربائية وازن الخلايا لمدة خمس دقائق.
لتسجيل مقاطع فيديو الانكماش باستخدام الفحص المجهري المستند إلى الفيديو ، افتح برنامج تسجيل الفيديو واضبط معدل إطارات يبلغ 100 إطار في الثانية. ثم حدد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار بالقرب من مركز الطبقة الأحادية hiPSC-CM. ثم يحفز الحقل الخلايا بمولد نبض تجاري لتسريع أحاديات الطبقات العضلية القلبية 2D كهربائيا.
ضع الخلية العضلية القلبية عند عتبة 1.5 مرة عند هرتز واحد مع معلمات النبض الأساسية. على سبيل المثال ، نبضات سرعة الموجة المربعة أحادية الطور مع مدة نبضة تحفيز 2 مللي ثانية تبلغ خمسة فولت. سجل فيديو الانكماش الأساسي للسرعة فقط قبل CCM لمدة لا تقل عن خمس نبضات.
ثم قم بتحفيز الطبقة الأحادية للخلايا العضلية القلبية بإشارة كهربائية تجريبية تبلغ 30 مللي ثانية تأخير ، ونبضتان متماثلتان ثنائية الطور لمدة 5.14 مللي ثانية ، مع مدة إجمالية تبلغ 20.56 مللي ثانية ، وسعة طور 10 فولت ، وفاصل زمني بين الطور صفري. سجل فيديو الانكماش الناجم عن CCM لمدة لا تقل عن خمس نبضات. قم بإيقاف تشغيل إشارة CCM ، وقم بالتحفيز بنبض سرعة خط الأساس وسجل فيديو انكماش لفترة الاسترداد بعد CCM لمدة لا تقل عن خمس نبضات.
استخدم برنامج انكماش قياسي لتحليل مقاطع فيديو الانكماش تلقائيا وتحديد الخصائص الانقباضية الرئيسية مثل سعة الانكماش ، ومنحدر الانكماش ، ومنحدر الاسترخاء ، والوقت حتى الذروة ، والوقت حتى خط الأساس 90٪ ومدة الانكماش 50٪ تم تمييز الخصائص التعاقدية أحادية الطبقة لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC البشرية وتم تحديد المعلمات الرئيسية لانقباض عضلة القلب. أدى تطبيق معلمات تحفيز CCM القياسية إلى تحسين خصائص الانقباض في المختبر. تم تقييم آثار تعديل تركيزات الكالسيوم خارج الخلية على خصائص انقباض الإنسان مع وبدون تحفيز CCM.
لوحظ اعتماد خط الأساس المتوقع للكالسيوم للانكماش ، بالإضافة إلى زيادة مستحثة في حساسية الكالسيوم على مستوى الطبقة الأحادية للخلايا العضلية القلبية. بالإضافة إلى ذلك ، كشف الاستجواب الدوائي لمسار إشارات بيتا أندروجيني أن تأثيرات التقلص العضلي التي يسببها CCM كانت جزئيا بوساطة إشارات بيتا الأدرينالية. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذه الأداة لتشمل خلايا عضلة القلب الخاصة بالمريض ، بما في ذلك اعتلال عضلة القلب التوسعي لفهم تأثير CCM في سياق حالات المرض.
هنا ، نركز بشكل أساسي على تقييم خصائص انقباض الإنسان. ومع ذلك ، باستخدام هذه الأداة ، يمكن للمرء أيضا تقييم قراءات اقتران تقلص الإثارة القلبية الأخرى بما في ذلك إمكانات الفعل ومعالجة الكالسيوم. هذه هي أول أداة علمية تنظيمية تجمع بين الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات عن طريق التكنولوجيا مع تقييم أجهزة القلب.
تمهد هذه الطريقة البديلة الطريق لتقييم الأجهزة الطبية في طبق ولديها القدرة على تقليل الحاجة إلى اختبار المواد الحيوانية والبشرية.
