FDAの科学工学研究所は、医療機器開発者とFDAレビュー担当者を支援するための規制科学ツールを開発しています。私たちの究極の目標は、利用可能な最高の科学を通じて、革新的で安全かつ効果的な医療機器への患者のアクセスを加速することです。このプロトコルでは、生命を脅かす心臓病の治療に使用される医療機器の評価に最先端の人工多能性幹細胞技術を適用します。
このシンプルなツールは、標準的な実験装置を使用して、皿内の心臓電気生理学デバイスの再現性のある評価を可能にします。また、さまざまな心臓病のドナーに由来する患者固有の細胞にも使用できます。まず、融解したヒトiPS細胞由来心筋細胞を、柔軟なヒドロゲル基材上に心筋細胞を播種する少なくとも2日前に、0.1%ゼラチンコーティングされた滅菌6ウェルプレートにプレートします。
ヒトiPS細胞由来心筋細胞を標準的な心筋細胞培地中で摂氏37度、二酸化炭素5%で2〜4日間培養し、凍結保存から回復させます。使用済みの培地を48時間ごとに100%心筋細胞培地でリフレッシュします。解離前のヒトiPS細胞由来心筋細胞の状態を、細胞の健康状態を評価して確認し、生存率と安定した拍動を確保します。
塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを含まないDPBSのウェルあたり4ミリリットルで心筋細胞を洗浄します。1ミリリットルの室温解離試薬を各ウェルに加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、10ミリリットルの心筋細胞培地を滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に加える。
1, 000マイクロリットルのピペットで6ウェルプレートから心筋細胞を解離し、細胞懸濁液を円錐管に加える。ウェルを1ミリリットルの新鮮な心筋細胞培地ですすぎ、残留心筋細胞を収集して円錐管に加えます。次に、円錐管の最終容量を培地で15ミリリットルにします。
チューブを200 Gで5分間遠心分離し、上清を1ミリリットルマークまで除去します。心筋細胞培地中の細胞を最終容量5ミリリットルまで再懸濁し、手動または自動セルカウンターで心筋細胞をカウントします。次に、心筋細胞懸濁液を室温で約30分間インキュベートし、柔軟なヒドロゲル基質を調製する。
1マイクロリットルにセットされた20マイクロリットルのピペット、ピペットチップ、滅菌48ウェルガラス底板、および組織培養フード内のストップウォッチタイマーを用意します。細胞外マトリックスまたはECMベースのヒドロゲル基質をチューブを軽くたたき、すぐに氷上に戻して混合します。最初のヒドロゲル基板をめっきする直前にストップウォッチタイマーを開始し、これを時間ゼロとしてマークします。
1マイクロリットルのヒドロゲル基質を約3回上下にピペットし、ピペットチップを冷却する。次に、約1マイクロリットルの未希釈のヒドロゲル基質を48ウェルプレートの各ウェルの底に水平に塗布し、ピペットを45度の角度で保持します。すべてのヒドロゲル基質を各ウェルに同じ向きでプレートして、40倍の倍率で実験を行うときに基質を識別できるようにします。
蓋を48ウェルプレートに置き、ヒドロゲル基質を組織培養フード内で室温で8〜10分間インキュベートしてから、細胞を追加します。インキュベーション後、直ちに、約200マイクロリットルの心筋細胞培地の低容量培地中に、ウェル当たり約30,000個の生存可能な心筋細胞を有するヒドロゲル基質上に心筋細胞を直接播種する。蓋を閉めた後、心筋細胞をフード内で室温で10〜15分間邪魔されずにインキュベートし、細胞がヒドロゲル基質に接着できるようにします。
100マイクロリットルの新鮮な心筋細胞培地を各ウェルに穏やかに加えます。蓋を閉じたプレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜4日間インキュベーターに置きます。顕微鏡と環境制御チャンバーの電源を入れて、摂氏37度と5%二酸化炭素に平衡化します。
心筋細胞培地を48ウェルプレートから取り出し、600マイクロリットルの心収縮性調節またはCCMアッセイ培地で各ウェルを2回静かにすすぎます。次に、ウェルあたり300マイクロリットルのCCMアッセイ培地を追加し、48ウェルプレートを環境制御チャンバー内の顕微鏡上に置きます。電極を挿入し、セルを5分間平衡化します。
ビデオベースの顕微鏡を使用して収縮ビデオを録画するには、ビデオ録画ソフトウェアを開き、フレームレートを毎秒100フレームに設定します。次に、hiPSC-CM単層の中心付近の関心領域またはROIを選択します。次に、市販のパルス発生器で細胞を電界刺激し、2D心筋細胞単層を電気的にペースアップします。
心筋細胞をベースラインパルスパラメータで1ヘルツの1.5倍の閾値に配置します。例えば、5ボルトの2ミリ秒の刺激パルス持続時間を有する単相矩形波ペーシングパルス。CCMの前にベースラインペーシングのみの収縮ビデオを最低5ビート録画します。
次に、30ミリ秒の遅延の実験的電気信号、5.14ミリ秒の位相持続時間の2つの対称的な二相性パルス、20.56ミリ秒の合計持続時間、10ボルトの位相振幅、およびゼロの位相間間隔で心筋細胞単層を刺激します。CCM誘発収縮ビデオを最低5拍記録します。CCM信号をオフにし、ベースラインペーシングパルスで刺激し、CCM後の回復期間の収縮ビデオを最低5拍記録します。
標準の収縮ソフトウェアを使用して収縮ビデオを自動的に分析し、収縮振幅、収縮勾配、緩和勾配、ピークまでの時間、ベースラインまでの時間90%、収縮時間50%などの主要な収縮特性を定量化2DヒトiPS細胞由来の心筋細胞単層契約特性を特徴付け、心筋細胞収縮性の主要なパラメーターを定量化しました。標準的なCCM刺激パラメータの適用は、in vitroで強化された収縮特性をもたらした。CCM刺激の有無にかかわらず、細胞外カルシウム濃度調節がヒトの収縮特性に及ぼす影響を評価した。
予想されるベースラインの収縮カルシウム依存性、ならびに心筋細胞単層レベルでのカルシウム感受性のCCM誘発性の増加が観察された。さらに、ベータアンドロゲンシグナル伝達経路の薬理学的調査により、CCM誘発変力効果はベータアドレナリン作動性シグナル伝達によって部分的に媒介されることが明らかになりました。さらに、このツールは、拡張型心筋症を含む患者固有の疾患心筋細胞に拡張して、病状の文脈におけるCCMの効果を理解することができます。
ここでは、主に人間の収縮特性の評価に焦点を当てています。ただし、このツールを使用すると、活動電位やカルシウム処理など、他の心臓興奮収縮カップリングの読み出しを評価することもできます。これは、人工多能性幹細胞を技術によって心臓デバイスの評価と組み合わせた最初の規制科学ツールです。
この代替方法は、医療機器を皿で評価する道を開き、動物およびヒトを対象とした検査の必要性を減らす可能性があります。
