FDA의 Office of Science and Engineering Laboratories는 의료 기기 개발자와 FDA 검토자를 지원하기 위한 규제 과학 도구를 개발하고 있습니다. 우리의 궁극적인 목표는 이용 가능한 최고의 과학을 통해 혁신적이고 안전하며 효과적인 의료 기기에 대한 환자의 접근을 가속화하는 것입니다. 이 프로토콜에서 우리는 생명을 위협하는 심장 상태를 치료하는 데 사용되는 의료 기기의 평가에 최첨단 유도 만능 줄기 세포 기술을 적용합니다.
이 간단한 도구를 사용하면 표준 실험실 장비를 사용하여 접시에 있는 심장 전기생리학 장치를 재현 가능한 방식으로 평가할 수 있습니다. 또한 다양한 심장 질환을 앓고 있는 기증자로부터 추출한 환자 특이적 세포와 함께 사용할 수 있습니다. 먼저, 유연한 하이드로겔 기질에 심근 세포를 파종하기 최소 2일 전에 해동된 인간 iPSC 유래 심근 세포를 0.1% 젤라틴 코팅된 멸균 6웰 플레이트에 플레이트합니다.
인간 iPSC 유래 심근 세포를 표준 심근 세포 배지에서 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 2-4 일 동안 배양하여 냉동 보존에서 회복 할 수 있도록합니다. 48 시간마다 100 % 심근 세포 배지로 소비 된 배지를 새로 고칩니다. 세포의 건강을 평가하여 해리 전에 인간 iPSC 유래 심근 세포의 상태를 확인하여 생존력과 안정적인 박동을 보장합니다.
염화칼슘 또는 염화마그네슘 없이 DPBS의 웰 당 4밀리리터로 심근세포를 세척한다. 각 웰에 1 밀리리터의 실온 해리 시약을 첨가하고 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양한다. 다음으로, 10 밀리리터의 심근 세포 배지를 멸균 된 15 밀리리터의 원추형 튜브에 첨가한다.
1, 000 마이크로 리터 피펫으로 6 웰 플레이트에서 심근 세포를 해리시키고 세포 현탁액을 원추형 튜브에 첨가한다. 1 밀리리터의 신선한 심근 세포 배지로 우물을 헹구어 잔류 심근 세포를 수집하고 원추형 튜브에 첨가하십시오. 그런 다음 원추형 튜브의 최종 부피를 매체와 함께 15 밀리리터로 가져옵니다.
튜브를 200G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 1밀리리터 표시까지 제거합니다. 심근 세포 배지의 세포를 5 밀리리터의 최종 부피로 재현 탁하고 수동 또는 자동 세포 계수기로 심근 세포를 계수합니다. 다음으로, 심근세포 현탁액을 상온에서 약 30분 동안 배양하면서 유연한 하이드로겔 기질을 제조한다.
1마이크로리터 크기의 20마이크로리터 피펫 세트, 피펫 팁, 멸균된 48웰 유리 바닥판 및 조직 배양 후드에 스톱워치 타이머를 준비합니다. 세포외 기질 또는 ECM 기반 하이드로겔 기질을 튜브를 가볍게 두드려 혼합하고 즉시 얼음 위에 다시 놓습니다. 첫 번째 하이드로겔 기판을 도금하기 직전에 스톱워치 타이머를 시작하고 이를 시간 0으로 표시합니다.
1 마이크로리터의 하이드로겔 기재를 약 3회 위아래로 피펫팅하여 피펫 팁을 냉각시킨다. 그런 다음 희석되지 않은 하이드로겔 기질 약 1마이크로리터를 48웰 플레이트의 각 웰 바닥에 수평으로 도포하고 피펫을 45도 각도로 유지합니다. 40X 배율로 실험을 수행할 때 기질을 식별하는 데 도움이 되도록 각 웰에서 동일한 방향으로 모든 하이드로겔 기질을 플레이트합니다.
48-웰 플레이트에 뚜껑을 놓고 하이드로겔 기질이 세포를 추가하기 전에 조직 배양 후드에서 실온에서 8 내지 10분 동안 인큐베이션되도록 합니다. 배양 후, 심근 세포를 약 200 마이크로 리터의 심근 세포 배지의 낮은 배지 부피에서 웰 당 약 30, 000 개의 생존 가능한 심근 세포로 하이드로 겔 기질 상에 직접 적가한다. 뚜껑을 닫은 후, 심근 세포가 후드에서 실온에서 10-15 분 동안 방해받지 않고 배양되도록하여 세포가 하이드로 겔 기질에 부착 할 수 있도록합니다.
100 마이크로 리터의 신선한 심근 세포 배지를 각 웰에 부드럽게 첨가하십시오. 뚜껑이 닫힌 접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소의 인큐베이터에 2-4일 동안 놓습니다. 현미경과 환경 제어 챔버를 켜서 섭씨 37도와 이산화탄소 5%로 평형을 이룹니다.
48-웰 플레이트로부터 심근세포 배지를 제거하고, 600 마이크로리터의 심장 수축성 조절 또는 CCM 분석 배지로 각 웰을 2회 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 웰당 300마이크로리터의 CCM 분석 배지를 추가하고 48웰 플레이트를 환경 제어 챔버의 현미경에 놓습니다. 전극을 삽입하고 5 분 동안 셀을 평형화하십시오.
비디오 기반 현미경을 사용하여 수축 비디오를 녹화하려면 비디오 녹화 소프트웨어를 열고 프레임 속도를 초당 100프레임으로 설정합니다. 그런 다음 hiPSC-CM 단층의 중심 근처에서 관심 영역 또는 ROI를 선택합니다. 그런 다음 상용 펄스 발생기로 세포를 자극하여 2D 심근 세포 단층의 속도를 전기적으로 조절합니다.
심근 세포를 기준선 펄스 매개 변수로 1 헤르츠에서 1.5 배 임계 값에 놓습니다. 예를 들어, 2밀리초의 자극 펄스 지속 시간이 5볼트인 단상 구형파 페이싱 펄스입니다. CCM 전에 최소 5박자 동안 기준선 페이싱만 수축 비디오를 녹화합니다.
그런 다음 30밀리초 지연의 실험적 전기 신호, 5.14밀리초 위상 지속 시간의 대칭 이상성 펄스 2개, 총 지속 시간 20.56밀리초, 위상 진폭 10볼트 및 간기 간격 0으로 심근 세포 단층을 자극합니다. CCM으로 인한 수축 비디오를 최소 5회 동안 녹화합니다. CCM 신호를 끄고 기준선 페이싱 펄스로 자극하고 CCM 후 회복 기간의 수축 비디오를 최소 5비트 동안 녹화합니다.
표준 수축 소프트웨어를 사용하여 수축 비디오를 자동으로 분석하고 수축 진폭, 수축 기울기, 이완 기울기, 피크까지의 시간, 기준선까지의 시간 90% 및 수축 지속 시간 50%와 같은 주요 수축 특성을 정량화합니다.2D 인간 iPSC 유래 심근 세포 단층 계약 특성을 특성화하고 심근 세포 수축성의 주요 매개변수를 정량화했습니다. 표준 CCM 자극 파라미터의 적용은 시험관 내에서 향상된 수축 특성을 가져왔습니다. CCM 자극이 있거나 없는 인간 수축 특성에 대한 세포외 칼슘 농도 조절의 효과를 평가했습니다.
수축의 예상되는 기준선 칼슘 의존성뿐만 아니라 심근 세포 단층 수준에서 CCM에 의해 유도 된 칼슘 민감도 증가가 관찰되었습니다. 또한, 베타 안드로겐 신호 전달 경로의 약리학적 조사는 CCM 유도 근수축 효과가 부분적으로 베타 아드레날린 신호 전달에 의해 매개된다는 것을 밝혀냈습니다. 또한, 이 도구는 질병 상태의 맥락에서 CCM의 효과를 이해하기 위해 확장성 심근병증을 포함한 환자 특이적 질병 심근 세포로 확장될 수 있습니다.
여기서는 주로 인간의 수축 특성을 평가하는 데 중점을 둡니다. 그러나 이 도구를 사용하면 활동 전위 및 칼슘 처리를 포함한 다른 심장 여기 수축 커플링 판독값도 평가할 수 있습니다. 이것은 기술에 의한 유도 만능 줄기 세포를 심장 장치 평가와 결합한 최초의 규제 과학 도구입니다.
이 대체 방법은 의료 기기를 접시에서 평가할 수 있는 길을 열어주고 동물 및 인간 대상 테스트의 필요성을 줄일 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
