Управление научных и инженерных лабораторий FDA разрабатывает нормативные научные инструменты для помощи разработчикам медицинских устройств и рецензентам FDA. Наша конечная цель — ускорить доступ пациентов к инновационным, безопасным и эффективным медицинским устройствам с помощью наилучших доступных научных данных. В этом протоколе мы применяем передовую технологию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для оценки медицинских устройств, которые используются для лечения опасных для жизни сердечных заболеваний.
Этот простой инструмент позволяет воспроизвести оценку устройств электрофизиологии сердца в чашке с использованием стандартного лабораторного оборудования. Он также может быть использован с специфическими для пациента клетками, полученными от доноров с различными сердечными заболеваниями. Для начала размороженные кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека, помещают на стерильные шестилуночные планшеты, покрытые 0,1%-ным желатином, по крайней мере, за два дня до посева кардиомиоцитов на гибкий гидрогелевый субстрат.
Культивируйте кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека, в стандартной среде кардиомиоцитов в течение двух-четырех дней при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы они могли восстановиться после криоконсервации. Обновляйте отработанную среду 100%-ной кардиомиоцитарной средой каждые 48 часов. Проверьте состояние кардиомиоцитов, полученных из ИПСК человека, перед диссоциацией, оценив здоровье клеток, обеспечив жизнеспособность и стабильное биение.
Промойте кардиомиоциты четырьмя миллилитрами DPBS на лунку без хлорида кальция или хлорида магния. Добавьте по одному миллилитру реагента для диссоциации при комнатной температуре в каждую лунку и выдерживайте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте 10 миллилитров кардиомиоцитарной среды в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Диссоциируйте кардиомиоциты из шестилуночных планшетов с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров и добавьте клеточную суспензию в коническую трубку. Промойте лунки одним миллилитром свежей кардиомиоцитарной среды, чтобы собрать остаточные кардиомиоциты и добавить их в коническую трубку. Затем доведите конечный объем конической трубки до 15 миллилитров со средой.
Центрифугируйте пробирку при 200 G в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость до отметки в один миллилитр. Ресуспендируют клетки в среде кардиомиоцитов до конечного объема пять миллилитров и подсчитывают кардиомиоциты с помощью ручного или автоматического счетчика клеток. Затем инкубируют суспензию клеток кардиомиоцитов в течение примерно 30 минут при комнатной температуре, пока готовятся гибкие гидрогелевые субстраты.
Приготовьте 20-литровую дозатор объемом 1 микролитр, наконечники пипеток, стерильную стеклянную нижнюю пластину с 48 лунками и таймер секундомера в вытяжке для культивирования тканей. Смешайте внеклеточный матрикс или гидрогелевый субстрат на основе ECM, осторожно постукивая по трубке и сразу же помещая ее обратно на лед. Запустите таймер секундомера непосредственно перед нанесением покрытия на первую гидрогелевую подложку и отметьте это как нулевое время.
Пипеткой нанесите один микролитр гидрогелевой подложки вверх и вниз примерно три раза, чтобы охладить наконечник пипетки. Затем нанесите примерно по одному микролитру неразбавленной гидрогелевой субстраты горизонтально на дно каждой лунки в 48-луночной пластине, удерживая пипетку под углом 45 градусов. Нанесите все гидрогелевые субстраты в одинаковой ориентации в каждой лунке, чтобы помочь идентифицировать подложку при выполнении экспериментов с 40-кратным увеличением.
Накройте крышкой 48-луночную пластину и дайте гидрогелевым субстратам инкубироваться в течение восьми-10 минут при комнатной температуре в колпаке для культивирования тканей, прежде чем добавлять клетки. После инкубации немедленно высевают кардиомиоциты по каплям непосредственно на гидрогелевые субстраты с примерно 30 000 жизнеспособных кардиомиоцитов на лунку в низком среднем объеме около 200 микролитров кардиомиоцитарной среды. После закрытия крышки дайте кардиомиоцитам спокойно инкубироваться в течение 10-15 минут при комнатной температуре в вытяжке, чтобы клетки могли прилипнуть к гидрогелевому субстрату.
Аккуратно добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежей кардиомиоцитарной среды. Поместите закрытую крышкой тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на два-четыре дня. Включите микроскоп и камеру контроля окружающей среды, чтобы уравновесить температуру до 37 градусов по Цельсию и 5% углекислого газа.
Извлеките кардиомиоцитарную среду из 48-луночной пластины и осторожно промойте каждую лунку дважды 600 микролитрами модуляции сократимости сердца или средой для анализа CCM. Затем добавьте 300 микролитров проанализирующей среды СКК на лунку и поместите 48-луночную пластину на микроскоп в камеру контроля окружающей среды. Вставьте электроды и уравновесьте клетки в течение пяти минут.
Чтобы записать видео сокращения с помощью видеомикроскопии, откройте программное обеспечение для записи видео и установите частоту кадров 100 кадров в секунду. Затем выберите интересующую область или окупаемость инвестиций вблизи центра монослоя hiPSC-CM. Затем поле стимулирует клетки с помощью коммерческого генератора импульсов для электрического темпа монослоев 2D-кардиомиоцитов.
Поместите кардиомиоцит на 1,5-кратный порог при одном герце с исходными параметрами пульса. Например, монофазные импульсы прямоугольной волны с длительностью стимульного импульса в две миллисекунды пять вольт. Запишите видео о сокращении только базового темпа перед CCM в течение как минимум пяти ударов.
Затем стимулируют монослой кардиомиоцитов экспериментальным электрическим сигналом с задержкой 30 миллисекунд, двумя симметричными двухфазными импульсами фазовой длительностью 5,14 миллисекунды, общей длительностью 20,56 миллисекунды, амплитудой фазы 10 вольт и нулевым межфазным интервалом. Запишите видео сокращения, вызванного CCM, как минимум на пять ударов. Выключите сигнал СКК, стимулируйте импульс базовой стимуляции и запишите видео сокращения периода восстановления после СКК в течение как минимум пяти ударов.
Используйте стандартное программное обеспечение для автоматического анализа видео сокращения и количественной оценки ключевых сократительных свойств, таких как амплитуда сокращения, наклон сокращения, наклон релаксации, время до пика, время до исходного уровня 90% и продолжительность сокращения 50%Были охарактеризованы контрактные свойства монослоя кардиомиоцитов, полученных из 2D человеческого ИПСК, и количественно определены ключевые параметры сократимости кардиомиоцитов. Применение стандартных параметров стимуляции СКК привело к усилению сократительных свойств in vitro. Оценено влияние модуляции внеклеточных концентраций кальция на сократительные свойства человека при стимуляции СКК и без нее.
Наблюдалась ожидаемая исходная кальциевая зависимость сокращения, а также индуцированное СКК повышение чувствительности к кальцию на уровне монослоя кардиомиоцитов. Кроме того, фармакологический опрос бета-андрогенного сигнального пути показал, что индуцированные СКК инотропные эффекты были частично опосредованы бета-адренергической передачей сигналов. Кроме того, этот инструмент может быть расширен до кардиомиоцитов конкретного заболевания, в том числе кардиомиопатии дилатационной кардиомиопатии, чтобы понять влияние СКК в контексте болезненных состояний.
Здесь мы фокусируемся в первую очередь на оценке сократительных свойств человека. Однако, используя этот инструмент, можно также оценить другие показания связи с сокращением сердечного возбуждения, включая потенциалы действия и обработку кальция. Это первый регуляторный научный инструмент, сочетающий индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с помощью технологии с оценкой сердечных устройств.
Этот альтернативный метод прокладывает путь для оценки медицинских устройств в чашке и может снизить потребность в тестировании на животных и людях.
