هذه طريقة مائية غير جراحية لقياس بنية نظام الجذر باستخدام معدات المختبر الروتينية. يسمح هذا البروتوكول بالتصور الكامل لنظام جذر النبات بالكامل عن طريق نشره يدويا. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لتحليل RSA في أنه يسمح بدراسة نظام جذر النبات دون الحاجة إلى أي تلوث عنصري غير مرغوب فيه.
يمكن لهذه الطريقة تسجيل التفاعل البيئي المباشر بما في ذلك الظروف الهرمونية والمغذيات والمناخية مع RSA للأنظمة النباتية. ابدأ التعقيم السطحي لبذور أرابيدوبسيس عن طريق نقع مغرفة صغيرة من حوالي 100 بذرة في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة ، قم بطرد البذور لفترة وجيزة عند 500 جرام لمدة خمس ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي منضدي.
بعد ذلك ، صب الماء ، وأضف 700 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ قبل تحريك الأنبوب لبضع ثوان. الطرد المركزي البذور مرة أخرى. إذا لزم الأمر ، كرر الدوامة والطرد المركزي ، مما يضمن أن 70٪ من علاج الإيثانول لا يتجاوز ثلاث دقائق.
بعد ثلاث دقائق ، شطف البذور على الفور بالماء المعقم. بعد ذلك ، عالج البذور باستخدام مبيض تجاري مخفف يحتوي على قطرة من TWEEN 20 لمدة سبع دقائق. امزج البذور بمحلول التبييض عن طريق قلب الأنابيب بسرعة من ثماني إلى 12 مرة.
بعد طرد مركزي قصير ، صب المادة الطافية باستخدام ماصة ملليلتر واحد ، وشطف البذور خمس مرات على الأقل بالماء المعقم ، باتباع نفس الإجراء الدوامة. اترك البذور المعقمة السطحية في الماء ، واحتضنها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند أربع درجات مئوية للتقسيم الطبقي. الأوتوكلاف صندوق أرجواني قياسي نصف مملوء بالماء المقطر.
قم بتقطيع لوح البولي كربونات المعقم إلى مستطيلات أربعة × ثمانية سنتيمترات مع نقطة منتصف محززة أكثر من منتصف الطريق عبر المستطيل بحيث يمكن فتح مستطيلين معا لتشكيل شكل X. استخدم هذا الإعداد لتثبيت شبكة البولي بروبلين بحجم 250 ميكرومتر مقطعة إلى ستة مربعات في ستة سنتيمترات. في خزانة تدفق الهواء الصفحي ، أضف وسائط قاعدية معقمة نصف MS مع الفيتامينات بالإضافة إلى 1.5٪ سكروز إلى كل صندوق للوصول إلى الحافة السفلية لشبكة البولي بروبلين.
زرع البذور المعقمة السطحية على الشبكة المائية ، وتنمو لمدة ثلاثة أيام. بعد ثلاثة أيام ، انقل الشتلات إلى شبكة بحجم المسام 500 ميكرومتر ، واتركها تنمو لمدة يومين. بعد ذلك ، انقل الشتلات إلى وسائط التحكم وإلى الوسائط التجريبية ، واترك البذور تنمو لمدة سبعة أيام.
أضف 10 إلى 20 ملليلتر من ماء الصنبور المصفى المعقم إلى لوحة بتري. اسحب الشتلات برفق من شبكة 500 ميكرومتر. بمساعدة فرشاة فنية مستديرة ، انشر الجذور الشبيهة بالنباتات في الطبق المملوء بالماء واغمرها في الماء.
قم بإمالة اللوحة قليلا لإزالة الماء. امسح أو صور لوحات بتري هذه بشكل مناسب. قم بقياس بنية نظام الجذر ، أو سمات RSA ، باستخدام برنامج ImageJ المتاح مجانا ، ثم افتح الملف المراد تحليله.
بعد ضبط المقياس، استخدم أداة الخط المستقيم لإنشاء تحديد خط يحدد شريط المقياس. قم بإنهاء المخطط التفصيلي بالنقر بزر الماوس الأيمن أو النقر المزدوج أو النقر في المربع الموجود في البداية. لقياس طول شريط المقياس المعروف بالبكسل ، انقر فوق تحليل ، متبوعا بالقياس على شريط الأدوات.
قم بتدوين طول البكسل. افتح مربع حوار ضبط المقياس بالنقر فوق علامة تبويب ضبط المقياس في علامة تبويب التحليل. تحقق من طول البكسل في حقل المسافة بالبكسل.
بعد ذلك ، أدخل قيمة شريط المقياس في حقل المسافة المعروف ، واضبط وحدة الطول على أنها ملليمترات. قفل المقياس لهذه الصورة بالذات من خلال النقر على موافق. استخدم أداة الخط المجزأ لتحديد خط يحدد طول الجذر.
بعد الانتهاء من المخطط التفصيلي ، اضبط تحديد الخط بالنقر فوق المقابض الصغيرة بالأبيض والأسود وسحبها على طول المخطط التفصيلي. ضمن علامة تبويب التحليل في ImageJ ، حدد أمر القياس وحدد طول الجذر. انقل البيانات المقاسة إلى جدول بيانات عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على نافذة النتائج ، وتحديد نسخ الكل من القائمة المنبثقة ، والتبديل إلى جدول البيانات ، ولصق البيانات.
لقياس وحساب سمات RSA ، قم بقياس طول الجذر الأساسي بين تقاطع hypocotyl إلى نهاية أطراف الجذر. ثم قم بقياس الجذور الجانبية من الدرجة الأولى ، أو طول درجة واحدة LR ، والجذور الجانبية من الدرجة الثانية ، أو طول LR بمقدار درجتين. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انسخ جميع القياسات والصقها في جدول البيانات.
قم بقياس وتسجيل المنطقة المتفرعة للجذر الأساسي ، أو BZPR ، التي تمتد من أول نقطة ناشئة للجذر الجانبي إلى آخر نقطة ناشئة للجذر الجانبي. وبالمثل ، سجل عدد الجذور الجانبية التي تنشأ داخل حدود BZPR. بعد ذلك ، قم بقياس متوسط طول الجذور الجانبية من الدرجة الأولى والعليا.
اشتقاق متوسط طول الجذور الجانبية الأولية بقسمة الطول الكلي للجذور الجانبية الأولية على إجمالي عدد الجذور الجانبية الأولية. ثم لقياس متوسط طول الجذور الجانبية من الدرجة الثانية، احسب متوسط طول الجذور الجانبية الثانوية بقسمة الطول الكلي للجذور الجانبية الثانوية على إجمالي عدد الجذور الجانبية الثانوية. قم بقياس كثافة الجذر الجانبي الأساسي بقسمة عدد الجذور الجانبية الأولية على طول BZPR.
بعد ذلك ، قم بقياس المنطقة المتفرعة للجذور الجانبية الفردية واحسب كثافة الجذر الجانبي الثانوي بقسمة عدد الجذور الجانبية الثانوية على طول مناطق التفرع لأطوال الجذر الجانبي من الدرجة الثانية. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بقياس إجمالي طول الجذر ، أو TRL. هذا هو مجموع الجذور الأولية وأطوال الجذور الجانبية الأولية والثانوية.
عمل نظام الزراعة المائية المستخدم في هذه التجربة بشكل جيد ، مما يعكس النمط الظاهري المتناقض الواضح في ظل ظروف نقص الفوسفات غير العضوية والكافية. تم تحليل سمات RSA المختلفة في ظل أنظمة الفوسفات غير العضوية المتناقضة في الظروف المائية. استدعى العلاج بنقص الفوسفات غير العضوي نمطا ظاهريا للجذر يظهر RSA أقصر وأقل عمقا وأقل تشعبا ، مقارنة بحالة الفوسفات غير العضوية الكافية.
تم تخفيف طول الجذر الأساسي بشكل كبير في ظل حالة نقص الفوسفات غير العضوي. يشير الكسب الكبير والسريع في طول الجذر الأساسي في وجود 1.25 مللي مولار من الفوسفات غير العضوي أو وسائط التحكم إلى كفاءة النظام المائي ، ويعكس التغيرات الفيزيائية بشكل كاف. تم تقليل منطقة التفرع بشكل كبير في ظل حالة نقص الفوسفات غير العضوي.
انخفض متوسط طول الجذر الجانبي الأساسي بشكل كبير في حالة نقص pi. وبالمثل ، انخفض متوسط طول الجذر الجانبي الثانوي بسبب حالة نقص الفوسفات ، ومع ذلك ، كان أقل في الكمية من متوسط طول الجذر الجانبي الأولي. انخفض عدد الجذور الجانبية الأولية والثانوية بشكل كبير تحت حالة نقص الفوسفات ، مقارنة بحالة السيطرة ، 1.25 مليمول من الفوسفات غير العضوي.
لم تتغير كثافة الجذر الجانبي الأولي في ظل حالة نقص الفوسفات ، بالنسبة إلى حالة التحكم ، 1.25 مليمول من الفوسفات غير العضوي. لم تظهر كثافة الجذر الجانبي الثانوي أي تغيير كبير ، مما يشير إلى أهمية كثافة الجذر الجانبي لاكتساب نظرة ثاقبة على مرونة RSA. أزلت الشتلات بلطف من الشبكة باستخدام الملقط.
قمت بنشر الجذور في طبق مملوء بالماء باستخدام فرشاة مستديرة ، وجميع الجذور الأولية ، ونشرها بشكل مستقيم ، ونشر الجذور الجانبية بشكل متماثل ، ونشر الجذور الجانبية من الدرجة الثانية المرتبطة بالجذور الجانبية من الدرجة الأولى. يمكن استخدام طريقة مماثلة لحساب مساحة السخام لأطراف نبات أرابيدوبسيس. يمكن نشر أوراق Arabidopsis على اللوحة الأخرى متبوعة بالتقاط الصور وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ المتاح مجانا لتحديد منطقة السخام.
يمكن استخدام هذا البروتوكول للإجابة على أي أسئلة حول تأثير البيئة على مرونة نظام الجذر.
