これは、日常的なラボ機器を使用して根系アーキテクチャを測定するための非侵襲的な水耕栽培法です。このプロトコルは、手動で広げることによって植物の根系全体を完全に視覚化することを可能にする。RSA分析の主な利点の1つは、不要な元素汚染を導入することなく植物の根系を研究できることです。
この方法は、ホルモン、栄養素、および気候条件を含む直接的な環境相互作用を植物システムのRSAと記録することができる。シロイヌナズナの種子の表面殺菌は、室温の蒸留水に約100個の種子の小さなスクープを浸すことから始めます。30分後、卓上遠心分離機を使用して種子を500 Gで5秒間短時間遠心分離します。
次に、水をデカントし、チューブを数秒間ボルテックスする前に700マイクロリットルの70%エタノールを追加します。種子を再度遠心分離します。必要に応じて、ボルテックスと遠心分離を繰り返し、70%エタノール処理が3分を超えないようにします。
3分後、直ちに滅菌水で種子を洗い流してください。次に、TWEEN20の滴を含む希釈市販の漂白剤を使用して種子を7分間処理します。チューブを8〜12回急速に反転させて、種子を漂白剤溶液と混合します。
短時間遠心分離した後、1ミリリットルのピペットを使用して上清をデカントし、同じボルテックス手順に従って、滅菌水で種子を少なくとも5回すすぎます。表面滅菌した種子を水中に残し、成層のために摂氏4度で2〜3日間インキュベートします。標準のマゼンタボックスを蒸留水で半分満たしたオートクレーブ。
オートクレーブ処理したポリカーボネートシートを4 x 8センチメートルの長方形にカットし、長方形の半分以上で中点に切り込みを入れて、2つの長方形が一緒にスロットしてX字型を形成できるようにします。このセットアップを使用して、6 x 6センチメートルの正方形にカットされた250マイクロメートルの細孔サイズのポリプロピレンメッシュを保持します。層流キャビネットで、ビタミンと1.5%スクロースを含む滅菌ハーフMS基礎培地を各ボックスに追加して、ポリプロピレンメッシュの下端に到達します。
表面滅菌種子を水耕栽培でメッシュに播種し、3日間栽培します。3日後、苗を500マイクロメートルの孔径メッシュに移し、2日間成長させます。次に、苗を対照培地と実験培地に移し、種子を7日間成長させます。
10〜20ミリリットルのオートクレーブ滅菌ろ過水道水をペトリプレートに加えます。500マイクロメートルのメッシュから苗をそっと引き出します。丸いアートブラシの助けを借りて、水で満たされたプレートに植物のような根を広げ、それらを水に浸します。
プレートを少し傾けて水を取り除きます。これらのペトリプレートを適切にスキャンまたは撮影します。無料で入手できるImageJソフトウェアを使用してルートシステムアーキテクチャまたはRSA特性を測定し、分析するファイルを開きます。
縮尺を設定したら、直線ツールを使用して、縮尺記号の輪郭を描く線の選択範囲を作成します。アウトラインを終了します 右クリック、ダブルクリック、または最初のボックス内をクリックします。既知の縮尺記号の長さをピクセル単位で測定するには、[分析]、[ツールバーの測定]の順にクリックします。
ピクセルの長さをメモします。[解析] タブの [縮尺の設定] タブをクリックして、[縮尺の設定] ダイアログ ボックスを開きます。ピクセル単位の距離フィールドでピクセルの長さを確認します。
次に、既知の距離フィールドに縮尺記号の値を入力し、長さの単位をミリメートルに設定します。[OK]をクリックして、この特定の画像のスケールをロックします。セグメント化されたラインツールを使用して、ルートの長さの輪郭を描くラインを選択します。
アウトラインが完成したら、アウトラインに沿って小さな白黒のハンドルをクリックしてドラッグして、ラインの選択を調整します。ImageJ の [解析] タブで、計測コマンドを選択し、ルートの長さを定量化します。測定データをスプレッドシートに転送するには、結果ウィンドウを右クリックし、ポップアップメニューから[すべてコピー]を選択し、スプレッドシートに切り替えてデータを貼り付けます。
RSA形質の測定と計算のために、胚軸接合部から根の先端までの間の一次根の長さを測定します。次に、1次側根、または1度のLR長、および2次の側根、または2度のLR長を測定します。完了したら、すべての測定値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。
最初の側根の出現点から最後の側根の出現点にまたがる一次根(BZPR)の分岐ゾーンを測定して記録します。同様に、BZPRの境界内を起点とする側根の数を記録します。次に、一次および高次側根の平均長さを測定します。
一次側根の全長を一次側根の総数で割ることにより、一次側根の平均長さを導出します。次に2次側根の平均長さを測定し、二次側根の全長を二次側根の総数で割ることにより二次側根の平均長さを算出する。一次側根の数をBZPRの長さで割ることにより、一次側根密度を測定します。
次に、個々の側根の分岐帯を測定し、二次側根の数を2次側根長の分岐帯の長さで割ることにより、二次側根密度を算出する。完了したら、ルートの全長、つまりTRLを測定します。これは、一次根と一次および二次側根の長さの集合体です。
この実験で使用された水耕栽培システムは、無機リン酸塩欠乏および十分な条件下での明らかな対照的な表現型を反映して、うまく機能しました。様々なRSA形質を、水耕栽培条件下で対照的な無機リン酸レジームの下で分析した。無機リン酸欠乏処理は、無機リン酸十分条件と比較して、より短く、より浅く、そしてより少ない分岐RSAを示す根表現型を呼び起こした。
一次根長は無機リン酸欠乏条件下で有意に減弱した。1.25ミリモルの無機リン酸塩または対照培地の存在下での一次根長の有意かつ急速な増加は、水耕栽培システムの効率を示し、生理学的変化を適切に反映しました。分岐帯は無機リン酸欠乏条件下で有意に減少した。
一次側根の平均長はπ欠損条件において有意に減少した。リン酸欠乏状態により、平均二次側根長も同様に減少したが、平均一次側根長よりも量が少なかった。一次および二次側根の数は、対照の1.25ミリモル無機リン酸条件と比較して、リン酸塩欠乏条件下で大幅に減少しました。
一次側根密度は、リン酸欠乏条件下では変化せず、対照に対して、1.25ミリモルの無機リン酸条件であった。二次側根密度は有意な変化を示さず、RSA可塑性への洞察を得るための側根密度の重要性を示しています。ピンセットを使ってメッシュから苗をそっと取り除きました。
丸いブラシを使用して水で満たされたプレートに根を広げ、すべての一次根をまっすぐに広げ、側根を対称的に広げ、一次側根にリンクされた二次側根を広げます。同様の方法を使用して、シロイヌナズナの植物の先端のすす面積を計算することができます。シロイヌナズナの葉をもう一方のプレートに広げた後、無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して画像をキャプチャおよび分析し、すす領域を決定することができます。
このプロトコルは、ルートシステムの可塑性に対する環境の影響に関する質問に答えるために使用できます。
