Hierbei handelt es sich um eine nicht-invasive hydroponische Methode zur Messung der Wurzelsystemarchitektur mit routinemäßigen Laborgeräten. Dieses Protokoll ermöglicht die vollständige Visualisierung des gesamten Wurzelsystems der Pflanze durch manuelles Spreizen. Einer der Hauptvorteile der RSA-Analyse besteht darin, dass sie die Untersuchung des Pflanzenwurzelsystems ermöglicht, ohne dass dies zu unerwünschten elementaren Verunreinigungen führen kann.
Mit dieser Methode kann die direkte Umweltinteraktion einschließlich hormoneller, Nährstoff- und klimatischer Bedingungen mit der RSA von Pflanzensystemen aufgezeichnet werden. Beginnen Sie mit der Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen, indem Sie einen winzigen Messlöffel mit etwa 100 Samen in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur einweichen. Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die Samen kurz bei 500 g für fünf Sekunden mit einer Tischzentrifuge.
Als nächstes dekantieren Sie das Wasser und fügen 700 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu, bevor Sie das Röhrchen einige Sekunden lang vortexen. Zentrifugieren Sie die Samen erneut. Falls erforderlich, wiederholen Sie das Vortexen und Zentrifugieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Behandlung mit 70 % Ethanol nicht länger als drei Minuten dauert.
Spülen Sie die Samen nach drei Minuten sofort mit sterilem Wasser ab. Als nächstes behandeln Sie die Samen sieben Minuten lang mit verdünntem handelsüblichem Bleichmittel, das einen Tropfen TWEEN 20 enthält. Mischen Sie die Samen mit Bleichlösung, indem Sie die Röhrchen acht bis 12 Mal schnell umdrehen.
Nach einer kurzen Zentrifugation wird der Überstand mit einer Ein-Milliliter-Pipette umgefüllt und die Samen mindestens fünfmal mit sterilem Wasser gespült, wobei das gleiche Vortex-Verfahren folgt. Lassen Sie die oberflächlich sterilisierten Samen in Wasser und inkubieren Sie sie zwei bis drei Tage lang bei vier Grad Celsius zur Stratifizierung. Autoklavieren Sie die magentafarbene Standardbox, die zur Hälfte mit destilliertem Wasser gefüllt ist.
Schneiden Sie die autoklavierte Polycarbonatplatte in vier mal acht Zentimeter große Rechtecke mit einem Mittelpunkt, der mehr als in der Mitte des Rechtecks eingekerbt ist, so dass zwei Rechtecke zusammenpassen können, um eine X-Form zu bilden. Verwenden Sie diesen Aufbau, um das 250 Mikrometer große, porengroße Polypropylengewebe zu halten, das in sechs mal sechs Zentimeter große Quadrate geschnitten ist. Geben Sie im Laminar-Airflow-Schrank sterile halbe MS-Basalmedien mit Vitaminen plus 1,5 % Saccharose in jede Box, um die Unterkante des Polypropylengewebes zu erreichen.
Säen Sie die oberflächlich sterilisierten Samen hydroponisch auf das Netz und züchten Sie sie drei Tage lang. Übertragen Sie die Sämlinge nach drei Tagen auf ein 500 Mikrometer porengroßes Netz und lassen Sie sie zwei Tage lang wachsen. Als nächstes werden die Sämlinge auf das Kontrollmedium und auf das Versuchsmedium übertragen und die Samen sieben Tage lang wachsen lassen.
Geben Sie 10 bis 20 Milliliter autoklaviertes gefiltertes Leitungswasser auf die Petriplatte. Ziehen Sie die Sämlinge vorsichtig aus der 500-Mikrometer-Maschenweite. Verteilen Sie mit Hilfe eines runden Kunstpinsels pflanzenartige Wurzeln in der mit Wasser gefüllten Platte und tauchen Sie sie in Wasser.
Kippen Sie die Platte leicht, um das Wasser zu entfernen. Scannen oder fotografieren Sie diese Petriplatten entsprechend. Messen Sie die Root-Systemarchitektur oder RSA-Merkmale mit der frei verfügbaren ImageJ-Software und öffnen Sie dann die zu analysierende Datei.
Verwenden Sie nach dem Festlegen der Skalierung das Werkzeug für gerade Linien, um eine Linienauswahl zu erstellen, die die Maßstabsleiste umreißt. Beenden Sie die Gliederung, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, doppelklicken oder in das Feld am Anfang klicken. Um die Länge der bekannten Maßstabsleiste in Pixeln zu messen, klicken Sie in der Symbolleiste auf Analysieren und anschließend auf Messen.
Notieren Sie sich die Pixellänge. Öffnen Sie das Dialogfeld "Skalierung festlegen", indem Sie auf der Registerkarte "Analysieren" auf die Registerkarte "Skalierung festlegen" klicken. Überprüfen Sie die Pixellänge im Feld Abstand in Pixeln.
Geben Sie als Nächstes den Wert der Maßstabsleiste in das Feld "Bekannte Entfernung" ein, und legen Sie die Längeneinheit auf Millimeter fest. Sperren Sie den Maßstab für dieses bestimmte Bild, indem Sie auf OK klicken. Verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linien für eine Linienauswahl, die die Wurzellänge umreißt.
Nachdem Sie die Kontur fertiggestellt haben, passen Sie die Linienauswahl an, indem Sie auf die kleinen schwarz-weißen Griffe klicken und sie entlang der Kontur ziehen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Analysieren" von ImageJ den Befehl "Messen" aus, und quantifizieren Sie die Wurzellänge. Übertragen Sie die gemessenen Daten in eine Tabelle, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Ergebnisfenster klicken, alle kopieren aus dem Popup-Menü auswählen, zur Tabelle wechseln und die Daten einfügen.
Messen Sie für die Messung und Berechnung von RSA-Merkmalen die primäre Wurzellänge zwischen der Hypokotylverbindung und dem Ende der Wurzelspitzen. Messen Sie dann die Seitenwurzeln erster Ordnung oder ein Grad LR-Länge und die Seitenwurzeln zweiter Ordnung oder zwei Grad LR-Länge. Wenn Sie fertig sind, kopieren Sie alle Messungen und fügen Sie sie in die Tabelle ein.
Messen und zeichnen Sie die Verzweigungszone der Primärwurzel (BZPR) auf, die sich über den ersten Austrittspunkt der Seitenwurzel bis zum letzten Austrittspunkt der Seitenwurzel erstreckt. Erfassen Sie in ähnlicher Weise die Anzahl der Seitenwurzeln, die innerhalb der BZPR-Grenze entstehen. Messen Sie als Nächstes die durchschnittliche Länge der Seitenwurzeln erster und höherer Ordnung.
Leiten Sie die durchschnittliche Länge der primären Seitenwurzeln ab, indem Sie die Gesamtlänge der primären Seitenwurzeln durch die Gesamtzahl der primären Seitenwurzeln dividieren. Um dann die durchschnittliche Länge der Seitenwurzeln zweiter Ordnung zu messen, berechnen Sie die durchschnittliche Länge der sekundären Seitenwurzeln, indem Sie die Gesamtlänge der sekundären Seitenwurzeln durch die Gesamtzahl der sekundären Seitenwurzeln dividieren. Messen Sie die primäre Seitenwurzeldichte, indem Sie die Anzahl der primären Seitenwurzeln durch die Länge des BZPR dividieren.
Als nächstes messen Sie die Verzweigungszone einzelner Seitenwurzeln und berechnen die sekundäre Seitenwurzeldichte, indem Sie die Anzahl der sekundären Seitenwurzeln durch die Länge der Verzweigungszonen der Seitenwurzellängen zweiter Ordnung teilen. Wenn Sie fertig sind, messen Sie die Gesamtfußlänge oder TRL. Dies ist die Summe der Primärwurzeln und der primären und sekundären Seitenwurzellängen.
Das hydroponische System, das in diesem Experiment verwendet wurde, funktionierte gut und spiegelte den offensichtlich kontrastierenden Phänotyp unter anorganischen Phosphatmangel und ausreichenden Bedingungen wider. Verschiedene RSA-Merkmale wurden unter kontrastierenden anorganischen Phosphatregimen unter hydroponischen Bedingungen analysiert. Die Behandlung mit anorganischem Phosphatmangel rief einen Wurzelphänotyp hervor, der eine kürzere, flachere und weniger verzweigte RSA aufwies, verglichen mit der anorganischen Phosphat-Suffizienz-Bedingung.
Die primäre Wurzellänge war unter der anorganischen Phosphatmangelbedingung signifikant abgeschwächt. Eine signifikante und schnelle Zunahme der primären Wurzellänge in Gegenwart von 1,25 millimolar anorganischem Phosphat oder Kontrollmedien deutete auf die Effizienz des hydroponischen Systems hin und spiegelte die physiomorphologischen Veränderungen angemessen wider. Die Verzweigungszone war unter der anorganischen Phosphatmangelbedingung signifikant reduziert.
Die durchschnittliche Länge der primären Seitenwurzel war im pi-defizienten Zustand signifikant reduziert. Die durchschnittliche sekundäre Seitenwurzellänge war aufgrund des phosphatarmen Zustands ebenfalls reduziert, jedoch mengenmäßig geringer als die durchschnittliche primäre Seitenwurzellänge. Die Anzahl der primären und sekundären Seitenwurzeln nahm unter der phosphatarmen Bedingung stark ab, verglichen mit der Kontrollbedingung mit 1,25 millimolarem anorganischem Phosphat.
Die primäre laterale Wurzeldichte wurde unter der phosphatarmen Bedingung im Vergleich zur Kontrollbedingung mit 1,25 millimolarem anorganischem Phosphat nicht verändert. Die sekundäre Seitenwurzeldichte zeigte keine signifikante Veränderung, was auf die Bedeutung der Seitenwurzeldichte für den Einblick in die RSA-Plastizität hinweist. Ich habe die Sämlinge vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Netz entfernt.
Ich verteile die Wurzeln in einer mit Wasser gefüllten Platte mit einer Rundbürste, alle Primärwurzeln, und spreize sie gerade, spreizte die Seitenwurzeln symmetrisch, spreizte Seitenwurzeln zweiter Ordnung, die mit Seitenwurzeln erster Ordnung verbunden sind. Eine ähnliche Methode kann verwendet werden, um die Rußfläche von Arabidopsis-Pflanzenspitzen zu berechnen. Die Arabidopsis-Blätter können auf der anderen Platte verteilt werden, gefolgt von einer Bildaufnahme und Analyse mit der frei verfügbaren ImageJ-Software, um die Rußfläche zu bestimmen.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um alle Fragen über den Einfluss der Umwelt auf die Plastizität des Wurzelsystems zu beantworten.
