Это неинвазивный гидропонный метод измерения архитектуры корневой системы с использованием обычного лабораторного оборудования. Этот протокол позволяет полностью визуализировать всю корневую систему растения путем ее ручного распространения. Одним из основных преимуществ анализа RSA является то, что он позволяет изучать корневую систему растений, без необходимости которой может быть внесено нежелательное элементное загрязнение.
Этот метод может регистрировать прямое взаимодействие окружающей среды, включая гормональные, питательные вещества и климатические условия, с RSA растительных систем. Начните поверхностную стерилизацию семян арабидопсиса, замочив крошечную мерную ложку примерно из 100 семян в дистиллированной воде комнатной температуры. Через 30 минут кратковременно центрифугируйте семена при 500 г в течение пяти секунд с помощью настольной центрифуги.
Затем сцедите воду и добавьте 700 микролитров 70% этанола, прежде чем вращать трубку в течение нескольких секунд. Снова центрифугируйте семена. При необходимости повторите вихревое и центрифугирование, следя за тем, чтобы 70%-ная обработка этанола не превышала трех минут.
Через три минуты сразу же промойте семена стерильной водой. Затем обработайте семена разбавленным коммерческим отбеливателем, содержащим каплю TWEEN 20, в течение семи минут. Смешайте семена с раствором отбеливателя, быстро перевернув трубочки от восьми до 12 раз.
После короткого центрифугирования сцедите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом один миллилитр и промойте семена не менее пяти раз стерильной водой, следуя той же процедуре вихряния. Оставьте поверхность стерилизованных семян в воде и инкубируйте их в течение двух-трех дней при четырех градусах Цельсия для стратификации. Автоклав стандартный пурпурный ящик наполовину заполнен дистиллированной водой.
Разрежьте автоклавный поликарбонатный лист на прямоугольники размером четыре на восемь сантиметров с насечкой в середине прямоугольника, расположенной более чем посередине прямоугольника, чтобы два прямоугольника могли соединяться вместе, образуя X-образную форму. Используйте эту установку, чтобы удерживать полипропиленовую сетку размером 250 микрометров, разрезанную на квадраты размером шесть на шесть сантиметров. В шкафу с ламинарным воздушным потоком добавьте стерильную половину базальной среды MS с витаминами и 1,5% сахарозы в каждую коробку, чтобы достичь нижнего края полипропиленовой сетки.
Высевают поверхностно стерилизованные семена на сетку на гидропонике, и выращивают их в течение трех дней. Через три дня переложите саженцы на сетку размером пор 500 микрометров и дайте им расти в течение двух дней. Затем перенесите рассаду на контрольную среду и на экспериментальную среду и дайте семенам прорасти в течение семи дней.
Добавьте в чашку Петри от 10 до 20 миллилитров автоклавной фильтрованной водопроводной воды. Аккуратно вытащите саженцы из 500 микрометровой сетки. С помощью круглой художественной кисти разложите похожие на растения корни в заполненной водой тарелке и погрузите их в воду.
Слегка наклоните тарелку, чтобы удалить воду. Отсканируйте или сфотографируйте эти пластины Петри соответствующим образом. Измерьте архитектуру корневой системы или признаки RSA с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ, затем откройте файл для анализа.
После установки масштаба используйте инструмент «Прямая линия», чтобы создать выделенную линию, которая обводит масштабную линейку. Завершите структурирование, щелкнув правой кнопкой мыши, дважды щелкнув или щелкнув поле в начале. Чтобы измерить длину известной масштабной линейки в пикселях, нажмите «Анализ», а затем «Измерение» на панели инструментов.
Запишите длину в пикселях. Откройте диалоговое окно «Задать масштаб», щелкнув вкладку «Задать масштаб» на вкладке «Анализ». Проверьте длину в пикселях в поле «Расстояние в пикселях».
Затем введите значение масштабной линейки в поле известного расстояния и установите единицу измерения длины в миллиметрах. Заблокируйте масштаб для этого конкретного изображения, нажав «ОК». Используйте инструмент «Сегментированная линия» для выделения линии, которая обводит длину корня.
Закончив обводку, отрегулируйте выделение линии, щелкнув и перетащив маленькие черно-белые маркеры вдоль контура. На вкладке анализа ImageJ выберите команду измерения и количественно оцените длину корня. Перенесите измеренные данные в электронную таблицу, щелкнув правой кнопкой мыши окно результатов, выбрав «Копировать все» во всплывающем меню, переключившись на электронную таблицу и вставив данные.
Для измерения и расчета признаков RSA измерьте длину первичного корня между гипокотильным соединением и концом кончиков корней. Затем измерьте боковые корни первого порядка, или длину LR в один градус, и боковые корни второго порядка, или длину LR в два градуса. После этого скопируйте и вставьте все измерения в электронную таблицу.
Измерьте и запишите зону ветвления первичного корня (BZPR), которая охватывает первую точку выхода бокового корня до последней точки выхода бокового корня. Точно так же запишите количество боковых корней, берущих начало в границах BZPR. Затем измерьте среднюю длину боковых корней первого и более высокого порядка.
Выведите среднюю длину первичных боковых корней, разделив общую длину первичных боковых корней на общее количество первичных боковых корней. Затем, чтобы измерить среднюю длину боковых корней второго порядка, рассчитайте среднюю длину вторичных боковых корней, разделив общую длину вторичных боковых корней на общее количество вторичных боковых корней. Измерьте плотность первичных боковых корней, разделив количество первичных боковых корней на длину BZPR.
Затем измерьте зону ветвления отдельных боковых корней и рассчитайте плотность вторичных боковых корней, разделив количество вторичных боковых корней на длину зон ветвления боковых длин корней второго порядка. После этого измерьте общую длину корня, или TRL. Это совокупность первичных корней и длин первичных и вторичных боковых корней.
Гидропонная система, использованная в этом эксперименте, работала хорошо, отражая очевидный контрастный фенотип в условиях дефицита неорганических фосфатов и достаточных условиях. Различные признаки RSA были проанализированы при контрастных неорганических фосфатных режимах в гидропонных условиях. Лечение с дефицитом неорганического фосфата вызывало корневой фенотип, демонстрирующий более короткий, мелкий и менее разветвленный RSA по сравнению с достаточным состоянием неорганического фосфата.
Длина первичного корня была значительно ослаблена в условиях дефицита неорганических фосфатов. Значительное и быстрое увеличение длины первичного корня в присутствии 1,25 миллимолярного неорганического фосфата или контрольных сред указывало на эффективность гидропонной системы и адекватно отражало физиоморфологические изменения. Зона ветвления была значительно уменьшена в условиях дефицита неорганических фосфатов.
Средняя длина первичного бокового корня была значительно уменьшена в условиях дефицита pi. Средняя длина вторичного бокового корня также была уменьшена из-за дефицита фосфатов, однако она была меньше по количеству, чем средняя длина первичного бокового корня. Количество первичных и вторичных боковых корней значительно уменьшилось при дефиците фосфатов по сравнению с контрольным состоянием 1,25 миллимоляра неорганического фосфата.
Первичная плотность боковых корней не изменялась при дефиците фосфатов по сравнению с контрольным состоянием неорганического фосфата 1,25 миллимоля. Вторичная плотность боковых корней не показала каких-либо существенных изменений, что указывает на важность плотности боковых корней для понимания пластичности RSA. Аккуратно извлекла рассаду из сетки с помощью пинцета.
Я выкладываю корни в заполненную водой тарелку с помощью круглой кисти все первичные корни и расправляю прямо, симметрично распределяю боковые корни, распространяю боковые корни второго порядка, связанные с боковыми корнями первого порядка. Аналогичный метод можно использовать для расчета площади сажи верхушек растений Arabidopsis. Листья арабидопсиса можно разложить на другой пластине с последующим захватом и анализом изображения с использованием свободно доступного программного обеспечения ImageJ для определения площади сажи.
С помощью этого протокола можно ответить на любые вопросы о влиянии окружающей среды на пластичность корневой системы.
