لقد استخدمنا هذه الطريقة بنجاح لإنشاء نموذج فأر أكثر اتساقا مع التغيرات المرضية في رتق القناة الصفراوية. يمكن لهذه التقنية محاكاة أعراض رتق القناة الصفراوية الحاد والمزمن وهو أمر مفيد لأبحاث آلية المرض في المستقبل. بعد استخدام الأجسام المضادة ، تم إطالة وقت بقاء الفئران وتم تخفيف الأعراض ، مما يشير إلى التأثير العلاجي للأجسام المضادة على رتق القناة الصفراوية.
بعد تقسيم الفئران الوليدية إلى مجموعات مختلفة ، كما هو موضح في المخطوطة ، قم بمعالجة كل فأر بحقن داخل الصفاق من خمسة ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G قبل أربع ساعات من حقن فيروس الروتا الريسوس أو RRV لاستنفاد الخلايا الإيجابية Gr1. في غضون 24 ساعة بعد الولادة ، حقن الفأر الوليدي داخل الصفاق مع 20 ميكرولتر من فيروس الروتا ريسوس أو المالحة. بعد حقن RRV ، يتم تطبيق 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G في بطن الفأر.
تحقق وسجل مظهر ووزن وبقاء جميع الفئران يوميا. للحقن داخل الصفاق ، قم بفضح بطن الفأر الصغير عن طريق قرص جلد الرقبة بإصبع السبابة والإبهام بيد واحدة وإمساك الأرجل الخلفية للفأر برفق بإصبع البنصر وإصبع الذيل. ارفع إبرة المحقنة في منحدر تصاعدي وأدخل الإبرة في منتصف الفخذ من الساق الخلفية اليمنى للفأر بزاوية 15 درجة مع الجلد.
أثناء تحريك الإبرة على طول المسار تحت الجلد حتى تصل إلى الحافة الساحلية اليمنى للماوس ، قم بتوجيه الإبرة لأسفل إلى تجويف البطن وحقن السائل تحت كبد الفأر. اسحب الإبرة للخارج مباشرة بعد الحقن. مراقبة النزيف أو التسرب في موقع الحقن.
بعد تخدير الماوس في اليوم 12 ، قم بتشريحه تحت المجهر. أدخل حقنة أنسولين سعة ملليلتر واحد في البطين الأيسر للقلب لجمع الدم. الطرد المركزي الدم عند 400 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وفصل المصل لقياسات وظائف الكبد.
تشريح كبد الفأر والطحال من الأنسجة المحيطة باستخدام المقص والملاقط. تصوير المظهر العام للكبد والقناة الصفراوية. بعد التخدير بالاستنشاق ، قم بفضح الكبد والمرارة والقنوات الصفراوية خارج الكبد بالمقص ومسحات القطن.
تحت مجهر الموقف ، قم بحقن خمسة إلى 10 ميكرولترات من صبغة الفلورسنت Rhodamine 123 في المرارة باستخدام حقنة أنسولين سعة ملليلتر واحد والتقاط الصور. اغمر أنسجة كبد الفأر الطازجة في 10٪ فورمالين لمدة 24 ساعة. بمجرد تضمين الأنسجة في البارافين ، استخدم ميكروتوم البارافين لقطع كتلة البارافين إلى أقسام بسمك أربعة ميكرومتر ، ووضع قسمين متتاليين على نفس الشريحة.
ثم ضع الشرائح في رف تقطيع ، وقم بإزالة الشمع منها في الزيلين ، وقم بترطيبها على التوالي في الإيثانول المطلق ، والإيثانول 95٪ ، والإيثانول 80٪ ، والإيثانول 70٪ ، والماء المقطر لمدة خمس دقائق لكل منها. تلطيخ المقاطع بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة خمس دقائق ، وانقعها في 1٪ حمض الهيدروكلوريك و 75٪ كحول لمدة خمس ثوان. بعد شطف الأقسام بالماء النظيف ، قم بتلطيخها بمحلول eosin لمدة دقيقة واحدة.
تحضير أقسام الأنسجة للتلطيخ ، كما هو موضح سابقا ، وإجراء إصلاح المستضد باستخدام العازلة Tris-EDTA. سخني الأقسام في فرن الميكروويف على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم أخرجيها وبردها بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة. لإزالة البيروكسيديز الداخلي ، ضع أقسام الأنسجة في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 دقائق ، وعالج الشرائح بمصل الماعز 5٪ لمنع الارتباط غير المحدد.
بعد ذلك ، أضف Cytokeratin 19 المضاد للفأر الأساسي المضاد للفأر أو الجسم المضاد أحادي النسيلة F4 / 80 للفأر إلى الأقسام ، واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم 3،3-برايم-ديامينوبنزيدين كعامل كروموجيني لمراقبة التفاعل الكروموجيني تحت المجهر.
راقب الشرائح تحت مجهر 40x للحصول على الصور وتحليلها حسب الحاجة. بمجرد تحضير أقسام الأنسجة وتلطيخها بالهيماتوكسيلين ، قم بتغطية كل نسيج ب 50 ميكرولترا من محلول صبغة سيريوس الحمراء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. جفف الشرائح بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، وأضف قطرة من العلكة المحايدة إلى كل شريحة ، واستخدم زلة غطاء لتغطية الأنسجة لتجنب الفقاعات.
اترك الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة لتصلب اللثة المحايدة. راقب تفاصيل ترسب الكولاجين باستخدام المجهر الضوئي المستقطب. حدد مجال رؤية واضحا ومناسبا ، واضبط السطوع وتوازن اللون الأبيض للمجال البصري للمجهر.
احصل على الصور وقم بتحليلها حسب الحاجة تحت مجهر 40x. بعد حقن RRV ، كان متوسط وقت البقاء على قيد الحياة في مجموعة RRV 13 يوما. أصيبت معظم الفئران التي عولجت بالجسم المضاد باليرقان الخفيف ولم يلاحظ أي فقدان للوزن.
أظهرت أكباد الفئران BA آفات نخرية وجزء خارج الكبد من رتق القناة الصفراوية. حجم الكبد أصغر من الضوابط. أظهر التحليل النسيجي أن جرعة منخفضة من العلاج المضاد ل Ly6G قللت من التهاب الوريد البابي.
لا يزال لوحظ تراكم الخلايا الالتهابية في شرائح أنسجة الكبد في اليوم 42. في اليوم 12 ، كانت هناك زيادة طفيفة في ترسب الكولاجين في منطقة البوابة. في اليوم 42 ، زاد تعبير الكولاجين بشكل ملحوظ ، وشوهد ترسب كبير للكولاجين في أنسجة BA.
لوحظت الخلايا الإيجابية CK19 في اليوم 12. في اليوم 42 ، زادت الخلايا الإيجابية CK19 ، ولكن كان هناك عدد قليل من القنوات الصفراوية الناضجة. تم حظر القناة الصفراوية خارج الكبد في الفئران المزمنة BA وكان لها ارتشاح التهابي من microphages.
كانت مستويات ALT و ALP في الكبد أعلى في مجموعة BA المزمنة منها في المجموعة الضابطة العادية. تمت زيادة إجمالي مستويات البيليروبين والبيليروبين المباشر والبيليروبين غير المباشر ، مما يشير إلى انخفاض وظائف الكبد بشكل كبير في مرحلة التليف المزمن من BA. يجب أن يتم الحقن بحذر حتى لا يثقب كبد الفأر. بعد الحقن ، يجب أن نأخذ حوالي 10 ثوان لمراقبة حالة الماوس وتنظيف الدم من الجرح.
