Hemos utilizado con éxito este método para crear un modelo de ratón que es más consistente con los cambios patológicos de la atresia biliar. Esta técnica puede simular los síntomas de la atresia biliar aguda y crónica, lo que es útil para la investigación futura del mecanismo de la enfermedad. Después del uso de anticuerpos, el tiempo de supervivencia de los ratones se prolongó y los síntomas se aliviaron, lo que sugiere el efecto terapéutico de los anticuerpos sobre la atresia biliar.
Después de dividir los ratones neonatos en diferentes grupos, como se describe en el manuscrito, pretrate a cada ratón con una inyección intraperitoneal de cinco microgramos de anticuerpo anti-Ly6G cuatro horas antes de la inyección de rhesus rotavirus o RRV para agotar las células Gr1 positivas. Dentro de las 24 horas posteriores al nacimiento, inyecte por vía intraperitoneal al ratón neonatal 20 microlitros de rotavirus rhesus o solución salina. Después de la inyección de RRV, administre 20 microgramos de anticuerpo anti-Ly6G en el abdomen del ratón.
Verifique y registre la apariencia, el peso y la supervivencia de todos los ratones diariamente. Para la inyección intraperitoneal, exponga el abdomen del ratón joven pellizcando la piel del cuello con el dedo índice y el pulgar de una mano y sosteniendo suavemente las patas traseras del ratón con el dedo anular y el dedo de la cola. Levante la aguja de la jeringa en una inclinación hacia arriba e inserte la aguja en el muslo medio de la pata trasera derecha del ratón en un ángulo de 15 grados con la piel.
Mientras mueve la aguja a lo largo de la vía subcutánea hasta que llegue al borde costal derecho del ratón, dirija la aguja hacia abajo en la cavidad abdominal e inyecte el líquido debajo del hígado del ratón. Saque la aguja inmediatamente después de la inyección. Observe si hay sangrado o fugas en el lugar de la inyección.
Después de anestesiar al ratón en el día 12, diseccionarlo bajo un microscopio. Inserte una jeringa de insulina de un mililitro en el ventrículo izquierdo del corazón para recolectar sangre. Centrifugar la sangre a 400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y separar el suero para medir la función hepática.
Diseccionar el hígado y el bazo del ratón de los tejidos circundantes usando tijeras y pinzas. Fotografía el aspecto general del hígado y el conducto biliar. Después de la anestesia por inhalación, exponga el hígado, la vesícula biliar y los conductos biliares extrahepáticos con tijeras e hisopos de algodón.
Bajo un microscopio de postura, inyecte de cinco a 10 microlitros del tinte fluorescente Rhodamine 123 en la vesícula biliar con una jeringa de insulina de un mililitro y tome fotografías. Sumerja el tejido hepático fresco del ratón en formalina al 10% durante 24 horas. Una vez que el tejido esté incrustado en parafina, use un micrótomo de parafina para cortar el bloque de parafina en secciones con un grosor de cuatro micrómetros, y coloque dos secciones consecutivas en el mismo portaobjetos.
Luego coloque las rodajas en una rejilla para rebanar, desencerarlas en xileno e hidratarlas sucesivamente en etanol absoluto, 95% etanol, 80% etanol, 70% etanol y agua destilada durante cinco minutos cada una. Tiñe las secciones con solución de hematoxilina durante cinco minutos y sumérjalas en ácido clorhídrico al 1% y alcohol al 75% durante cinco segundos. Después de enjuagar las secciones con agua limpia, tiñéndalas con solución de eosina durante un minuto.
Prepare las secciones de tejido para la tinción, como se demostró anteriormente, y realice la reparación de antígenos con tampón Tris-EDTA. Caliente las secciones en un horno de microondas a 95 grados centígrados durante 10 minutos, luego retírelas y enfríelas naturalmente a temperatura ambiente. Para eliminar la peroxidasa endógena, coloque las secciones de tejido en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos y trate las rodajas con suero de cabra al 5% para bloquear la unión no específica.
A continuación, agregue el anti-ratón primario Citoqueratina 19 de rata o el anticuerpo monoclonal anti-ratón F4/80 de rata a las secciones, e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Incubar las secciones con anticuerpos secundarios apropiados durante 30 minutos a temperatura ambiente. Use 3, 3-prime-diaminobencidina como agente cromogénico para observar la reacción cromogénica bajo el microscopio.
Observe las rebanadas bajo un microscopio de 40x para obtener imágenes y analizarlas según sea necesario. Una vez que las secciones de tejido estén preparadas y contrateñidas con hematoxilina, cubra cada tejido con 50 microlitros de solución de colorante rojo sirio a temperatura ambiente durante una hora. Seque los portaobjetos naturalmente a temperatura ambiente durante cuatro horas, agregue una gota de goma neutra a cada portaobjetos y use un cubreobjetos para cubrir el tejido y evitar burbujas.
Deje los portaobjetos a temperatura ambiente durante 24 horas para solidificar la goma neutra. Observe los detalles de la deposición de colágeno utilizando microscopía de luz de contraste polarizado. Seleccione un campo de visión claro y adecuado, y ajuste el brillo y el balance de blancos del campo visual del microscopio.
Obtenga imágenes y analícelas según sea necesario bajo un microscopio de 40x. Después de la inyección de RRV, el tiempo medio de supervivencia en el grupo de RRV fue de 13 días. La mayoría de los ratones tratados con el anticuerpo desarrollaron ictericia leve y no se observó pérdida de peso.
Los hígados de ratones BA mostraron lesiones necróticas y un segmento extrahepático de atresia del conducto biliar. El tamaño del hígado es más pequeño que el de los controles. El análisis histológico mostró que la terapia anti-Ly6G en dosis bajas disminuyó la inflamación de la vena porta.
La acumulación de células inflamatorias todavía se observó en las cortes de tejido hepático en el día 42. El día 12, hubo un ligero aumento en la deposición de colágeno en la región portal. En el día 42, la expresión de colágeno aumentó significativamente y se observó una deposición sustancial de colágeno en el tejido BA.
Las células CK19 positivas se observaron el día 12. En el día 42, las células CK19 positivas aumentaron, pero había pocos conductos biliares maduros. El conducto biliar extrahepático en ratones BA crónicos estaba bloqueado y tenía infiltrados inflamatorios de micrófagos.
Los niveles de ALT y ALP en el hígado fueron más altos en el grupo de BA crónica que en el grupo de control normal. Los niveles de bilirrubina total, bilirrubina directa y bilirrubina indirecta aumentaron, lo que indica que la función hepática se redujo significativamente en la etapa de fibrosis crónica de BA. La inyección debe hacerse con precaución para no perforar el hígado del ratón. Después de la inyección, debemos tomar unos 10 segundos para observar el estado del ratón y limpiar la sangre de la herida.
