Biliyer atrezinin patolojik değişiklikleriyle daha tutarlı bir fare modeli oluşturmak için bu yöntemi başarıyla kullandık. Bu teknik, gelecekteki hastalık mekanizması araştırmaları için yararlı olan akut ve kronik biliyer atrezi semptomlarını simüle edebilir. Antikor kullanımından sonra, farelerin hayatta kalma süresi uzadı ve semptomlar hafifletildi, bu da antikorun biliyer atrezi üzerindeki terapötik etkisini düşündürdü.
Yenidoğan fareleri farklı gruplara ayırdıktan sonra, makalede açıklandığı gibi, Gr1-pozitif hücreleri tüketmek için her fareye rhesus rotavirüs veya RRV enjeksiyonundan dört saat önce beş mikrogram anti-Ly6G antikorunun intraperitoneal enjeksiyonu ile ön muamele yapın. Doğumdan sonraki 24 saat içinde, yenidoğan faresine intraperitoneal olarak 20 mikrolitre rhesus rotavirüs veya salin enjekte edin. RRV enjeksiyonundan sonra, farenin karnına 20 mikrogram anti-Ly6G antikoru uygulayın.
Günlük olarak tüm farelerin görünümünü, ağırlığını ve hayatta kalmasını kontrol edin ve kaydedin. İntraperitoneal enjeksiyon için, boyun derisini bir elin işaret parmağı ve baş parmağı ile sıkıştırarak ve farenin arka bacaklarını yüzük parmağı ve kuyruk parmağıyla hafifçe tutarak genç farenin karnını açığa çıkarın. Şırınga iğnesini yukarı doğru eğimli bir şekilde kaldırın ve iğneyi farenin sağ arka bacağının orta uyluğuna ciltle 15 derecelik bir açıyla yerleştirin.
İğneyi farenin sağ kostal kenarına ulaşana kadar deri altı yolu boyunca hareket ettirirken, iğneyi karın boşluğuna yönlendirin ve sıvıyı farenin karaciğerinin altına enjekte edin. Enjeksiyondan hemen sonra iğneyi dışarı çekin. Enjeksiyon bölgesinde kanama veya sızıntı olup olmadığını gözlemleyin.
Fareyi 12. günde uyuşturduktan sonra, mikroskop altında diseke edin. Kan toplamak için kalbin sol ventrikülüne bir mililitrelik insülin şırıngası yerleştirin. Kanı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 g'da santrifüj edin ve karaciğer fonksiyon ölçümleri için serumu ayırın.
Fare karaciğerini ve dalağı makas ve cımbız kullanarak çevredeki dokulardan ayırın. Karaciğer ve safra kanalının genel görünümünü fotoğraflayın. İnhalasyon anestezisinden sonra, karaciğer, safra kesesi ve ekstrahepatik safra kanallarını makas ve pamuklu çubuklarla açığa çıkarın.
Bir duruş mikroskobu altında, floresan boya Rhodamine 123'ün beş ila 10 mikrolitresini bir mililitrelik insülin şırıngası ile safra kesesine enjekte edin ve fotoğraf çekin. Taze fare karaciğer dokusunu 24 saat boyunca% 10 formaline batırın. Doku parafine gömüldükten sonra, parafin bloğunu dört mikrometre kalınlığında bölümlere ayırmak için bir parafin mikrotomu kullanın ve aynı slayt üzerine iki ardışık bölüm yerleştirin.
Daha sonra dilimleri bir dilimleme rafına yerleştirin, ksilen içinde balmumundan arındırın ve her biri beş dakika boyunca mutlak etanol,% 95 etanol,% 80 etanol,% 70 etanol ve damıtılmış su içinde art arda nemlendirin. Bölümleri beş dakika boyunca hematoksilin çözeltisi ile lekeleyin ve beş saniye boyunca% 1 hidroklorik asit ve% 75 alkol içinde bekletin. Bölümleri temiz suyla duruladıktan sonra, bir dakika boyunca eozin çözeltisi ile lekeleyin.
Daha önce gösterildiği gibi doku bölümlerini boyama için hazırlayın ve Tris-EDTA tamponu ile antijen onarımı yapın. Bölümleri mikrodalga fırında 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın, ardından çıkarın ve doğal olarak oda sıcaklığına soğutun. Endojen peroksidazı çıkarmak için, doku bölümlerini 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit içine yerleştirin ve spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için dilimleri% 5 keçi serumu ile tedavi edin.
Daha sonra, bölümlere birincil sıçan anti-fare Sitokeratin 19 veya sıçan anti-fare F4/80 monoklonal antikoru ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Mikroskop altında kromojenik reaksiyonu gözlemlemek için kromojenik bir ajan olarak 3, 3-prime-diaminobenzidin kullanın.
Resim elde etmek ve gerektiğinde analiz etmek için dilimleri 40x mikroskop altında gözlemleyin. Doku bölümleri hazırlandıktan ve hematoksilin ile boyandıktan sonra, her dokuyu bir saat boyunca oda sıcaklığında 50 mikrolitre sirius kırmızı boya çözeltisi ile örtün. Slaytları dört saat boyunca oda sıcaklığında doğal olarak kurutun, her slayta bir damla nötr sakız ekleyin ve kabarcıkları önlemek için dokuyu örtmek için bir kapak kayması kullanın.
Nötr sakızı katılaştırmak için slaytları 24 saat oda sıcaklığında bırakın. Polarize kontrast ışık mikroskobu kullanarak kollajen birikimi ayrıntılarını gözlemleyin. Net ve uygun bir görüş alanı seçin ve mikroskopun görsel alanının parlaklığını ve beyaz dengesini ayarlayın.
Görüntüleri elde edin ve gerektiğinde 40x mikroskop altında analiz edin. RRV enjeksiyonundan sonra, RRV grubunda medyan sağkalım süresi 13 gündü. Antikor ile tedavi edilen farelerin çoğunda hafif sarılık gelişti ve kilo kaybı gözlenmedi.
BA farelerinin karaciğerlerinde nekrotik lezyonlar ve safra kanalı atrezisinin ekstrahepatik segmenti görüldü. Karaciğerin boyutu kontrollerden daha küçüktür. Histolojik analiz, düşük doz anti-Ly6G tedavisinin portal ven inflamasyonunu azalttığını gösterdi.
42. günde karaciğer doku dilimlerinde inflamatuar hücre birikimi hala gözlendi. 12. günde, portal bölgesinde kollajen birikiminde hafif bir artış oldu. 42. günde, kollajen ekspresyonu anlamlı olarak artmış ve BA dokusunda önemli kollajen birikimi görülmüştür.
CK19-pozitif hücreler 12. günde gözlendi. 42. günde, CK19 pozitif hücreler arttı, ancak az sayıda olgun safra kanalı vardı. Kronik BA farelerde ekstrahepatik safra kanalı bloke edildi ve mikrofajların inflamatuar infiltrasyonları vardı.
Karaciğerdeki ALT ve ALP düzeyleri kronik BA grubunda normal kontrol grubuna göre daha yüksekti. Toplam bilirubin, direkt bilirubin ve dolaylı bilirubin düzeyleri artmıştır, bu da BA'nın kronik fibroz evresinde karaciğer fonksiyonunun anlamlı derecede azaldığını göstermektedir. Enjeksiyon, fare karaciğerini delmemek için dikkatli yapılmalıdır. Enjeksiyondan sonra, farenin durumunu gözlemlemek ve kanı yaradan temizlemek için yaklaşık 10 saniye sürmeliyiz.
