この方法を用いて、胆道閉鎖症の病理学的変化により一致するマウスモデルを作成することに成功しました。この手法は、急性および慢性胆道閉鎖症の症状をシミュレートすることができ、将来の疾患メカニズム研究に役立ちます。抗体使用後、マウスの生存期間を延長し、症状が緩和され、胆道閉鎖症に対する抗体の治療効果が示唆された。
新生児マウスを異なるグループに分けた後、原稿に記載されているように、アカゲザルロタウイルスまたはRRV注射の4時間前に5マイクログラムの抗Ly6G抗体の腹腔内注射で各マウスを前処理して、Gr1陽性細胞を枯渇させます。生後24時間以内に、新生児マウスに20マイクロリットルのアカゲザルロタウイルスまたは生理食塩水を腹腔内注射する。RRV注射後、20マイクログラムの抗Ly6G抗体をマウスの腹部に投与する。
すべてのマウスの外観、体重、生存率を毎日確認して記録します。腹腔内注射の場合は、片手の人差し指と親指で首の皮膚をつまみ、薬指と尾指でマウスの後足をそっと保持して、若いマウスの腹部を露出させます。シリンジ針を上向きに持ち上げ、マウスの右後脚の中央に針を皮膚と15度の角度で挿入します。
マウスの右肋骨端に到達するまで針を皮下経路に沿って動かしながら、針を腹腔内に向け、マウスの肝臓の下に液体を注入します。注射後すぐに針を引き抜きます。注射部位での出血や漏れを観察します。
12日目にマウスに麻酔をかけた後、顕微鏡で解剖します。1ミリリットルのインスリン注射器を心臓の左心室に挿入して採血します。血液を400gで室温で5分間遠心分離し、肝機能測定のために血清を分離します。
マウスの肝臓と脾臓をハサミとピンセットを使用して周囲の組織から解剖します。肝臓と胆管の一般的な外観を撮影します。吸入麻酔後、肝臓、胆嚢、肝外胆管をハサミと綿棒で露出させます。
姿勢顕微鏡下で、1ミリリットルのインスリン注射器で5〜10マイクロリットルの蛍光色素ローダミン123を胆嚢に注入し、写真を撮ります。新鮮なマウス肝臓組織を10%ホルマリンに24時間浸します。組織がパラフィンに包埋されたら、パラフィンミクロトームを使用してパラフィンブロックを4マイクロメートルの厚さの切片に切断し、同じスライド上に2つの連続した切片を配置します。
次に、スライスをスライスラックに入れ、キシレンで脱ワックスし、無水エタノール、95%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、および蒸留水でそれぞれ5分間連続して水和します。切片をヘマトキシリン溶液で5分間染色し、1%塩酸と75%アルコールに5秒間浸します。切片をきれいな水ですすいだ後、エオジン溶液で1分間染色します。
前に示したように、染色用の組織切片を準備し、Tris-EDTAバッファーで抗原修復を行います。切片を95°Cの電子レンジで10分間加熱し、取り出して室温まで自然に冷却します。内因性ペルオキシダーゼを除去するには、組織切片を3%過酸化水素に10分間置き、スライスを5%ヤギ血清で処理して非特異的結合をブロックします。
次に、初代ラット抗マウスサイトケラチン19またはラット抗マウスF4/80モノクローナル抗体を切片に加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。切片を適切な二次抗体とともに室温で30分間インキュベートします。3,3-プライム - ジアミノベンジジンを発色剤として使用し、顕微鏡下で発色反応を観察します。
スライスを40倍の顕微鏡で観察して画像を取得し、必要に応じて分析します。組織切片を調製し、ヘマトキシリンで対比染色したら、各組織を50マイクロリットルのシリウスレッド色素溶液で室温で1時間覆います。スライドを室温で4時間自然乾燥させ、各スライドに中性ガムを一滴加え、カバースリップを使用して組織を覆い、気泡を防ぎます。
スライドを室温で24時間放置して、ニュートラルガムを固化させます。偏光造影光顕微鏡を使用してコラーゲン沈着の詳細を観察します。クリアで適切な視野を選択し、顕微鏡の視野の明るさとホワイトバランスを調整します。
画像を取得し、必要に応じて40倍の顕微鏡で分析します。RRV注射後、RRV群の生存期間の中央値は13日であった。抗体で治療されたマウスのほとんどは軽度の黄疸を発症し、体重減少は観察されませんでした。
BAマウスの肝臓は壊死性病変と胆管閉鎖症の肝外セグメントを示した。肝臓のサイズは対照よりも小さいです。組織学的分析は、低用量抗Ly6G療法が門脈炎症を減少させることを示した。
炎症性細胞の蓄積は、42日目に肝臓組織スライスで依然として観察されました。12日目に、門脈領域におけるコラーゲン沈着のわずかな増加があった。42日目に、コラーゲン発現は有意に増加し、BA組織に実質的なコラーゲン沈着が見られました。
CK19陽性細胞は12日目に観察された。42日目にCK19陽性細胞は増加したが、成熟胆管はほとんどなかった。慢性BAマウスの肝外胆管は閉塞し、マイクロファージの炎症性浸潤を有していた。
肝臓のALTおよびALPレベルは、正常対照群よりも慢性BA群で高かった。総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン濃度が上昇し、BAの慢性線維化期に肝機能が有意に低下したことが示された。注射は、マウスの肝臓に穿刺しないように注意して行う必要があります。注射後、マウスの状態を観察し、傷口から血液をきれいにするのに約10秒かかります。
