هذا الفيديو يوضح إنتاج وتطبيق شرائح الكبد قطع الدقة كنموذج تجريبية السابقين vivo من بيولوجيا أنسجة الكبد. شرائح الكبد الدقيقة التي تحتل مكانة تجريبية موجودة بين في الدراسات الحيوانية في الجسم الحي وأساليب ثقافة الخلايا في المختبر. هذه التقنية لديها العديد من الفوائد الرئيسية في دراسات الحيوانات الحية، بما في ذلك القدرة على استخدام عينات التحكم والعلاج من نفس الكبد، وعزل أنسجة الكبد لإزالة الآثار خارج الهدف من أنظمة الجهاز الأخرى، والقدرة على استخدام الكواشف التي قد يكون لها تأثير سلبي إذا طبقت على فأر حي كامل، على سبيل المثال، مثبطات المسارات السامة.
تتضمن هذه التقنية استخدام شفرة تهتز بشكل عرضي لقطع شرائح الكبد الرقيقة جدًا من أنسجة الكبد القابلة للحياة متبوعة بثقافة الأنسجة المختبرية. الاهتزازات من شفرة يمنع تمزق الناجمة عن الإجهاد القص. في هذا المثال، سوف نعرض تقنيات تحضيرات شرائح الكبد السابقين vivo قابلة للحياة، وإظهار فائدة ثقافة شريحة الكبد في التجارب سبيل المثال حيث يتم التعامل مع هذه الأنسجة الحية السابقة مع الأحماض الصفراوية لتحفيز إصابة الكبد cholestatic لتقييم آليات الخلايا الليفية الكبدية.
أدخل الشفرة في الذراع القاطع. تطهير شفرة والذراع قطع مع محلول الإيثانول 70٪. كن حذرا دائما لتجنب الاتصال مع شفرة.
تطهير علبة العازلة مع محلول الإيثانول 70٪ ، ومسحها مع الأنسجة المعقمة. أدخل علبة المخزن المؤقت في الاهتزاز وقم بتشدّد المسمار المتصاعد. تعيين الذراع القطع إلى أقصى ارتفاع المتاحة.
تحقق من زاوية النصل. على اهتزاز لدينا، ونحن نستخدم زاوية 10 درجة من الأفقي، مع شفرة المنحدرة إلى أسفل نحو العينة. تأكد من أن زاوية النصل ثابتة بإحكام.
تطهير حامل العينة، مرة أخرى، مع محلول الإيثانول 70٪. قم بتوصيل مياه التبريد لمبرد بلتيير الحراري، الموجود تحت درج العازلة. بعض نماذج هزاز استخدام حمام الجليد للتبريد بدلا من ذلك.
إصلاح أنبوب المياه خارج إلى استنزاف، وتشغيل الماء. تعيين برودة إلى أربع درجات مئوية. أضف عازل Krebs-Henseleit الجليدي البارد إلى علبة المخزن المؤقت.
يجب أن تكون جميع الأدوات والمواد الجراحية معقمة. يجب أن تكون الفئران تخديرًا عميقًا أو قتلًا رحيمًا. تم تطهير أسطح الجلد على الفئران عن طريق التبول مع محلول الإيثانول بنسبة 70٪.
إجراء شق في منتصف الجلد من قاعدة تجويف البطن إلى الحجاب الحاجز. باستخدام ملقط نظيفة ومقص، وفتح تجويف البطن. إزالة الكبد بسرعة، دون إتلاف الفصوص.
دفع الكبد إلى أسفل، وقطع النسيج الضام في الجزء العلوي من الكبد. دفع الكبد صعودا. عقد منطقة الأوعية الدموية مركز الكبد مع ملقط وسحب إلى أعلى.
قطع الأوعية الدموية النسيج الضام. الحرص على عدم تلف فصوص الكبد, وأيضا, الحرص على عدم قطع في الجهاز الهضمي. وضع الكبد إزالتها في طبق معقمة من الجليد الباردة كريبس-Henseleit العازلة.
فصل الكبد إلى فصوص فردية. حدد فص كبد واحد ووضع الجانب المسطح أسفل على طبق معقمة جديدة. إبقاء فصوص أخرى على الجليد في كريبس هينسيليت العازلة.
تقليم حواف فصوص الكبد. التشذيب مهم، لا سيما على الحافة التي سوف الاتصال شفرة القطع أولا، وجود حافة الأنسجة عمودي نسبيا على شفرة القطع سوف تمنع ضغط الأنسجة التي يمكن أن تحدث في زوايا ضحلة. قطع الأنسجة حول حواف الثلاثة الأخرى يزيل الكثير من كبسولات ليفية في حافة الأنسجة، وعادة ما يسمح إزالة أسهل من شرائح الأنسجة.
ضع طبقة رقيقة من الغراء سيانوكريلا على الحافة الأمامية لحامل العينة، أكبر قليلا من فصوص الكبد المشذبة. إزالة أي بقايا من العازلة من الأنسجة باستخدام مواد ماصة معقمة. وضع فص الكبد على الغراء سيانوكريات, مع أكبر حافة تواجه نحو الجبهة.
السماح لعلاج في الهواء لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ضع الأنسجة المتصلة بصاحب العينة في الاهتزاز. ضبط سرعة هزاز.
خفض شفرة القطع حتى يقع فوق فص الكبد. تشغيل ذراع قطع تهتز على العينة. يتم تنشيط الاهتزاز من النصل على هذا الجهاز من قبل دواسة القدم.
العودة إلى الوراء شفرة، وخفض ارتفاع شفرة بمقدار 250 ميكرومتر. كرر هذه العملية حتى تتم إزالة الطبقة العليا من الأنسجة. تجاهل أول شريحة أو شريحتين، حيث ستحتوي هذه الكبسولة غليسون، وبالتالي، لن تحتوي على الكثير من أنسجة الكبد الوظيفية.
لقطع شرائح الكبد، تقدم ببطء شفرة تهتز في الأنسجة عن طريق تحويل المقبض. استخدام فرشاة صغيرة لتوجيه بلطف الأنسجة أثناء عملية القطع. استخدام فرشاة لالتقاط قسم قطع الأنسجة، ومن ثم وضع قسم الأنسجة في أنبوب معقمة تحتوي على مخزن كريبس-هينسليت للتخزين.
عندما لا تكون قيد الاستخدام، والحفاظ على هذا الأنبوب على الجليد. بعض الوقت، والأنسجة لا المسيل للدموع أثناء عملية القطع، ولكن بالنسبة لمعظم الأغراض، والأنسجة لا تزال قابلة للاستخدام. قطع شرائح الأنسجة حتى بالقرب من الغراء سيانواكريلات.
لا تقطع الغراء كرر مع فصوص الكبد الأخرى، التي تجلس على الجليد، حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من شرائح الأنسجة. لتنظيف حامل العينة، إما استخدام شفرة لكشط خليط الغراء الأنسجة قبالة، أو يمكن تخفيف الخليط باستخدام المذيبات مثل الأسيتون أو ثنائي الميثيل السلفوكسيد.
في غطاء لثقافة الأنسجة، ماصة واحدة مل من وسط Williams'E تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنينية ومضادات الميكروبات في لوحة 12-جيدا. إزالة شرائح الأنسجة عن طريق دوامة بلطف الخليط وطرف في طبق معقمة. قطع الأنسجة إلى حجم موحد تقريبا.
في هذا المثال، نحن تهدف لشرائح الأنسجة مع مساحة سطح حوالي 50 ملليمتر مربع. الحرص على فحص شرائح الأنسجة للاتساق. تشير الشرائح الداكنة إلى زيادة سماكة الأنسجة ، ويجب التخلص منها.
شرائح أخف تشير إلى وجود صمغ سيانواكريلات الشفاء، وينبغي التخلص منها. نقل شرائح الأنسجة إلى لوحة 12-جيدا تحتوي على ملليلتر واحد من وسائل الإعلام. احتضان شرائح الكبد في ظل ظروف زراعة الأنسجة الطبيعية.
إذا كان ذلك ممكنا، واستخدام أساليب لتعزيز توافر الأكسجين لشرائح الأنسجة. في اليوم التالي، تغيير وسائل الإعلام باستخدام ماصة دليل لمنع فقدان الأنسجة عن طريق الشفط. شرائح الكبد الدقيقة هي الآن جاهزة للاستخدام التجريبي.
لتطبيقنا، تعاملنا شرائح الكبد مع الأحماض الصفراوية لمدة يومين، ومتجانسة في عازلة تحلل لاستخراج رسول RNA وتحليل qPCR. لفحص جدوى شرائح الكبد الدقيقة مع مرور الوقت، استخدمنا مستويات ATP كوكيل لقابلية الخلية. تم تطبيع مستويات ATP إلى البروتين ، وتم قياسها في نقاط زمنية متعددة بعد العزل.
وانخفضت مستويات ATP في العينات الفورية وساعة واحدة، ولكن هذا تعافى من قبل ثلاث ساعات. وبعد ذلك، تم الحفاظ على مستويات ATP لمدة خمسة أيام، على الرغم من أنها اتجهت نحو الانخفاض مع مرور الوقت. تم استخدام تلطيخ H&E لفحص شرائح الكبد الدقيقة التي تم الحفاظ عليها في الثقافة لمدة تصل إلى خمسة أيام.
كان مورفولوجيا الأنسجة موحية من بعض النخر التي تحدث في اليوم الثاني ، مع نخر شديد يحدث في اليوم الخامس. بسبب النخر يحدث بين يومين وخمسة أيام، نوصي الأداة التجريبية لهذه التقنية يقتصر على حوالي ثلاثة أيام. ومع ذلك، يمكن تعزيز هذا باستخدام أفضل تقنيات توصيل الأوكسجين إلى شرائح الأنسجة.
كما يبدو أن شرائح الكبد الدقيقة تحتوي على سماكة من ألياف الكولاجين بالنسبة للوقت في الثقافة. هذا هو موحية من العمليات الليفية العفوية التي تحدث. في التجربة المثال، تم التعامل مع شرائح الكبد الدقيقة مع ثلاثة أحماض الصفراوية منفصلة لمدة يومين، لمحاكاة cholestasis الكبد.
وبالنظر إلى تعبير مرنا عن ثلاثة جينات خاصة بتشولانجيوسيت، فإن الأحماض الصفراوية المترافقة، والأحماض الغليشوكية والتوروشولية، زادت بشكل كبير من التعبير عن كل من السيتوكيراتين-19 وconnexin-43. وهذا يتفق مع التنمية cholangiocyte. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء شرائح الكبد قطع دقيق، وكيفية تنفيذ زراعة الأنسجة الأساسية.
يمكن استخدام شرائح الكبد الدقيقة في مجموعة واسعة جدًا من التطبيقات ، بما في ذلك التحقيقات التجريبية في التعبير الريبي ، والتعبير البروتيني ، وعلم الوراثة اللاجينية ، وربط الحمض النووي ، والتمثيل الغذائي ، وآليات العدوى ، وغزو السرطان ، وعلم الصيدلة ، وبيولوجيا الخلايا ، ودراسات الإفراز ، فقط على سبيل المثال لا الحصر.
