كان توطين البروتينات في سياق البنية التحتية للخلية أداة بحثية قوية لعقود. باستخدام هذا البروتوكول ، قمنا بتوسيع البروتينات منخفضة الوفرة أو يصعب تحديد موقعها. نحن نستخدم المجهر الفلوري لتسمية البروتينات بطريقة حساسة وقابلة للفحص ودمجها مع المجهر الإلكتروني لإعادة ملء البنية التحتية للخلية.
سنعرض هنا CLEM في المقطع على بروتينات الالتهام الذاتي ، ولكن يمكن تطبيقه حقا على أي سؤال بيولوجي حيث تكون البنية التحتية للخلية ذات أهمية ، خاصة في دراسة الأحداث النادرة. سيوضح الإجراء معي Tineke Veenendaal ، فني أبحاث أول من مختبرنا. للبدء ، استبدل برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.15٪ جليكاين ب 1٪ جيلاتين في برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
كشط ونقل الخلايا في الجيلاتين إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بيليه الخلايا في 6،000 غرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي دقيق ثم قم بإزالة الجيلاتين دون إزعاج الحبيبات. أضف 12٪ جيلاتين دافئ إلى 37 درجة مئوية إلى الحبيبات وأعد تعليقه برفق عن طريق السحب بأطراف ماصة أو ماصات المراعي الزجاجية المسخنة مسبقا إلى نفس درجة الحرارة.
احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم حبيبات الخلايا في 6،000 غرام لمدة دقيقة واحدة. تصلب الجيلاتين على الجليد لمدة 30 دقيقة. لإزالة خلايا الجيلاتين المدمجة من الأنبوب ، اقطع طرف الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات من بقية الأنبوب بشفرة حلاقة.
ثم قطع نهاية الأنبوب مع بيليه الخلية في نصف عمودي على القطع الأول. ضع نصفي طرفي الأنبوب اللذين يحتويان على حبيبات الخلية في 2.3 سكروز مولاري واحتضانها لمدة 10 دقائق عند أربع درجات سلزية. يؤدي هذا إلى تقلص نصفي حبيبات الخلية قليلا وإزاحتها من الأنبوب البلاستيكي.
قم بإزالة نصفي الأنبوب باستخدام حبيبات الخلية المدمجة في الجيلاتين من السكروز ، ثم قم بإزالة نصفي حبيبات الخلية من نصفي الأنبوب البلاستيكي بالملاقط. قم بقص الحبيبات يدويا إلى كتل ذات حجم مناسب بشفرة حلاقة ، واستخدم مجهر تشريح ستيريو لتكبير الهدف أثناء القطع. احتضان كتل الخلية طوال الليل في 2.3 سكروز مولي عند أربع درجات مئوية.
ضعها على دبوس حامل عينة من الألومنيوم. اترك ما يكفي من السكروز حول حواف الكتلة بحيث تشكل طوقا رفيعا بين الكتلة والدبوس. قم بتجميده وتخزينه في النيتروجين السائل.
قم بقص الجزء الأمامي من الكتلة لتسطيح سطحها للحصول على أقسام بسمك 250 نانومتر. ثم قم بقص جوانب الكتلة عن طريق تقسيم 50 إلى 100 ميكرومتر في جانب وجه كتلة العينة بزاوية السكين. سيؤدي تقليم أربعة جوانب من وجه كتلة العينة إلى إنشاء مستطيل بارز حوالي 250 × 375 ميكرومتر.
قسم شريطا من المستطيل البارز لضمان أن يتراوح سمك المقاطع بين 70 و 90 نانومتر ولها لمعان ذهبي فضي. قم بتوجيه الأقسام بعيدا عن حافة السكين الماسي بشعر على عصا لإنشاء شريط طويل. التقط الشريط عن طريق غمس حلقة الالتقاط الثلاثة ملليمترات في خليط واحد لواحد من 2.3 سكروز مولي و 2٪ ميثيل سلولوز.
أدخل الحلقة في حجرة التبريد في الميكروتوم ، وبمجرد أن تبدأ القطرة في التجمد ، التقط الأقسام على الفور عن طريق الضغط برفق على القطرة ضدها. قم بإزالة الحلقة من غرفة التبريد. انتظر حتى تذوب القطرة تماما واضغط على القطرة على شبكة معدة.
ضع الشبكات ذات المقاطع على حوالي ملليلتر واحد من PBS في طبق صغير أو طبق متعدد الآبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بمعالجة الشبكات على حوالي 75 ميكرولترا من القطرات على Parafilm وابدأ بغسل الجلايسين PBS في درجة حرارة الغرفة. احتضن الشبكات بمخزن مؤقت مانع مصنوع من 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار C و 0.5٪ جيلاتين جلد السمك في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة كخطوة مانعة.
تمييع الأجسام المضادة الأولية في منع المخزن المؤقت في برنامج تلفزيوني واحتضان الشبكات على حوالي 10 قطرات ميكرولتر من هذا الحل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشبكات في 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار في برنامج تلفزيوني خمس مرات في درجة حرارة الغرفة. تمييع الأجسام المضادة الثانوية و DAPI في المخزن المؤقت للحظر في PBS.
ثم احتضان الشبكات على حوالي 10 قطرات ميكرولتر من هذا المحلول لمدة 30 دقيقة أو أكثر في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الشبكات في PBS خمس مرات كما هو موضح سابقا. لتركيب العينات للفحص المجهري الضوئي ، اغمر الشبكات في 50٪ من الجلسرين في الماء المقطر مرتين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع شبكة واحدة لكل زلة غطاء بين شريحة زجاجية وقسيمة غطاء في 50٪ من الجلسرين ، مع التأكد من أن الأقسام تواجه انزلاق الغطاء.
للفحص المجهري الضوئي ، خذ شريحة زجاجية مع الشبكات المحصورة إلى مجهر واسع المجال مع مرحلة آلية. حدد هدف زيت عالي التكبير وقم بإنشاء مجموعة تجانب صورة من شريط المقاطع. بعد ذلك ، للفك والمجهر الإلكتروني أو تباين EM ، أضف 10 ميكرولترات من الماء المقطر إلى جانب شطيرة انزلاق غطاء الشريحة الزجاجية ، وانتظر العمل الشعري لملء واجهة شطيرة انزلاق الغطاء الزجاجي.
قم بإزالة زلة الغطاء بعناية دون خلط زيت الغمر في الجلسرين. استرجع الشبكات بالملاقط واغمرها في الماء المقطر ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لغسل 50٪ من الجلسرين. جفف الجزء الخلفي من الشبكة بعناية باستخدام مناديل ورقية خالية من النسالة وضع جانب قسم الشبكات لأسفل على قطرات الماء المقطر.
لتلطيخ الأقسام للتباين في المجهر الإلكتروني ، قم باحتضانها بأسيتات اليورانيل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتبريد محلول ميثيل سلولوز أسيتات اليورانيل عن طريق وضع القطرات على Parafilm على صفيحة معدنية على الجليد. ثم اغسل الشبكات بهذا المحلول البارد المثلج مرتين واحتضانها في المحلول لمدة 10 دقائق.
قم بإخراج الشبكات عن طريق إدخال حلقة تجفيف شبكية في قطرة ميثيل سلولوز أسيتات اليورانيل أسفل كل شبكة ورفعها برفق حتى يتم سحب الشبكة من القطرة. لمسح المحلول الزائد ، المس الحلقة بزاوية 60 درجة تقريبا على ورق الترشيح الخالي من النسالة واسحبه ببطء على طول الورق حتى لا يتم امتصاص المزيد من المحلول. ضع الحلقة مع الشبكة في رف مناسب ، واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 10 دقائق.
استخدم النظرة العامة التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر الضوئي لتحديد منطقة الاهتمام للتصوير في المجهر الإلكتروني النافذ أو TEM ، وقم بالتعليق على عائد الاستثمار على مجموعة بيانات الفحص المجهري الضوئي. بمجرد تحديد منطقة، احصل على تجانب صورة تم تعيينه عند تكبير 20,000x إلى 50,000x في TEM. أعد إنشاء لوحة الصورة التي تم تعيينها في برنامج ما بعد المعالجة.
إجراء الارتباط بناء على إشارة DAPI والخطوط الفلورية والنووية في المجهر الإلكتروني. قم بتحويل الصور لتراكبها بدقة وقم بإجراء الارتباط اليدوي بدقة. تم تجويع خلايا HEPG2 المشتقة من الورم الأرومي الكبدي لمدة ساعتين في EBSS قبل التثبيت ب 4٪ paraldehyde لمدة ساعتين.
يكشف تصوير IF ل LC3 و LAMP1 على الأقسام عن عدد قليل نسبيا من نقاط LC3 والقليل من التمركز المشترك مع LAMP1. تم ربط المعلومات الجزيئية من IF بالمعلومات الهيكلية الفائقة التي تم الحصول عليها في المجهر الإلكتروني عن طريق تراكب طريقتي التصوير على أساس DAPI والخطوط العريضة النووية. كشف ارتباط العضيات الإيجابية LC3 بالبنية التحتية EM أن النقاط المختلفة تمثل مراحل متميزة من الالتهام الذاتي.
يتم عرض البنية التحتية للمقصورات الفردية المسماة LC3 كما يتضح من المربع الأول هنا. تظهر صور المجهر الإلكتروني الضوئي المتلازم على اليسار ، وتظهر صور المجهر الإلكتروني الملون الزائف على اليمين. يشار إلى الأغشية البلعمية الذاتية الداخلية والخارجية برؤوس سهام بيضاء وسوداء.
ومن المثير للاهتمام ، أن EM حددت بقع الفلورسنت الضعيفة نسبيا على أنها جسيمات ذاتية إيجابية LC3 ، والتي تتميز بمحتوى كثيف وحويصلات داخل اللمعة. يكشف هذا عن الحد الأدنى من رؤية LC3 في IF لأقسام التبريد الرقيقة للغاية ، مما يشير إلى LC3 القابل للكشف في الحالة الذاتية المستقرة على الرغم من البيئة المتحللة. ومع ذلك ، فإن النقط الموجبة LC3 تمثل بشكل أساسي البلعمة الذاتية مع القليل منها يمثل التحلل الذاتي.
بالنسبة للباحثين الذين يرغبون في وضع العلامات المناعية بدلا من CLEM في المقطع ، فإن البروتوكولات والنصائح الموضحة هنا قابلة للتطبيق تماما لوضع العلامات المناعية أيضا. قمنا في البداية بتطبيق CLEM على المقطع على البروتينات التنظيمية الاندوسومية ذات الوفرة المنخفضة وأظهرنا لأول مرة توطينها الداخلي البنيوي.
