A localização de proteínas no contexto da ultraestrutura da célula tem sido uma poderosa ferramenta de pesquisa há décadas. Com esse protocolo, ampliamos as proteínas que são de baixa abundância ou de difícil localização. Usamos microscopia de fluorescência para marcar proteínas de forma sensível e rastreável e combiná-la com microscopia eletrônica para reabastecer a ultraestrutura da célula.
Aqui demonstraremos em seção CLEM em proteínas de autofagia, mas ele pode realmente ser aplicado a qualquer questão biológica onde a ultraestrutura da célula é de interesse, especialmente no estudo de eventos raros. Quem demonstrará o procedimento comigo será Tineke Veenendaal, técnica sênior de pesquisa do nosso laboratório. Para começar, substitua o PBS contendo 0,15% de glicina por 1% de gelatina em PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius.
Raspar e transferir as células em gelatina para um tubo de microcentrífuga. Pellet as células a 6.000 G por um minuto à temperatura ambiente em uma microcentrífuga e, em seguida, remover a gelatina sem perturbar o pellet. Adicione 12% de gelatina aquecida a 37 graus Celsius ao pellet e ressuspenda suavemente pipetando com pontas de pipeta ou pipetas de pastagem de vidro pré-aquecidas à mesma temperatura.
Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, pellet as células a 6.000 G por um minuto. Solidifique a gelatina no gelo por 30 minutos. Para remover as células embutidas em gelatina do tubo, corte a extremidade do tubo que contém o pellet do resto do tubo com uma lâmina de barbear.
Em seguida, corte a extremidade do tubo com o pellet de célula ao meio perpendicular ao primeiro corte. Coloque as duas metades da extremidade do tubo contendo o pellet de células em sacarose de 2,3 molares e incube por 10 minutos a quatro graus Celsius. Isso faz com que as metades do pellet celular encolhem ligeiramente e se desloquem do tubo de plástico.
Remova as metades do tubo com o pellet de célula embutido em gelatina da sacarose e, em seguida, remova as metades do pellet de célula das metades do tubo de plástico com uma pinça. Corte manualmente o pellet em blocos de tamanho apropriado com uma lâmina de barbear e use um microscópio de dissecação estéreo para ampliar o objeto durante o corte. Incubar os blocos celulares durante a noite em sacarose 2,3 molares a quatro graus Celsius.
Coloque-os em um pino de suporte de amostra de alumínio. Deixe bastante sacarose ao redor das bordas do bloco para que ele forme um colar fino entre o bloco e o pino. Congele e armazene em nitrogênio líquido.
Corte a frente do bloco para achatar sua superfície para obter seções de cerca de 250 nanômetros de espessura. Em seguida, corte as laterais do bloco seccionando 50 a 100 micrômetros no lado da face do bloco de amostra com o canto da faca. O corte de quatro lados da face do bloco de amostra criará um retângulo saliente de cerca de 250 por 375 micrômetros.
Separe, uma fita do retângulo saliente, garantindo que as seções tenham entre 70 e 90 nanômetros de espessura e tenham um brilho dourado prateado. Guie as seções para longe da borda da faca de diamante com um cabelo em um bastão para criar uma fita longa. Pegue a fita mergulhando o laço de captação de três milímetros em uma mistura um-para-um de sacarose 2,3 molares e 2% metilcelulose.
Insira o laço na câmara de crio do micrótomo e, uma vez que a gota comece a congelar, pegue imediatamente as seções pressionando suavemente a gota contra elas. Remova o laço da câmara de crio. Espere até que a gota tenha descongelado completamente e pressione a gota em uma grade preparada.
Coloque as grades com seções em torno de um mililitro de PBS em um prato pequeno ou prato de vários poços e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Processe as grades em cerca de 75 microlitros de gotículas em Parafilm e comece com lavagens de glicina PBS à temperatura ambiente. Incubar as grades com um tampão de bloqueio composto por albumina C de soro bovino a 0,1% e gelatina de pele de peixe a 0,5% em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente como etapa de bloqueio.
Diluir os anticorpos primários em tampão de bloqueio em PBS e incubar as grades em gotículas de cerca de 10 microlitros desta solução por uma hora à temperatura ambiente. Lavar as grades em albumina de soro bovino a 0,1% em PBS cinco vezes à temperatura ambiente. Diluir os anticorpos secundários e o DAPI no tampão de bloqueio em PBS.
Em seguida, incube as grades em cerca de 10 gotículas de microlitros desta solução por 30 minutos ou mais à temperatura ambiente antes de lavar as grades em PBS cinco vezes, como mostrado anteriormente. Para montar as amostras para microscopia de luz, submergir as grades em glicerol a 50% em água destilada duas vezes por cinco minutos à temperatura ambiente. Coloque uma grade por deslizamento de tampa entre uma lâmina de vidro e uma lamínula de tampa em 50% de glicerol, garantindo que as seções estejam voltadas para a lamínula.
Para microscopia de luz, leve uma lâmina de vidro com as grades sanduíche para um microscópio de campo largo com um estágio automatizado. Selecione uma objetiva de óleo de alta ampliação e crie um conjunto de blocos de imagem da faixa de opções de seções. Em seguida, para desmontagem e microscopia eletrônica ou contraste EM, adicione 10 microlitros de água destilada ao lado do sanduíche deslizante da tampa de vidro e aguarde a ação capilar para preencher a interface sanduíche deslizante da tampa de vidro.
Remova cuidadosamente a tampa sem misturar óleo de imersão no glicerol. Recupere as grades com uma pinça e submerja-as em água destilada três vezes à temperatura ambiente para lavar o glicerol a 50%. Seque cuidadosamente a parte de trás da grade com um papel de seda sem fiapos e coloque a seção das grades de lado para baixo em gotículas de água destilada.
Para corar os cortes para contraste em microscopia eletrônica, incubá-los com acetato de uranila por cinco minutos à temperatura ambiente. Arrefecer a solução de metilcelulose de acetato de uranila colocando as gotículas em Parafilm sobre uma placa de metal sobre gelo. Em seguida, lave as grades com esta solução gelada duas vezes e incube-as na solução por 10 minutos.
Enrole as grades inserindo um laço de secagem de grade na gota de metilcelulose de acetato de uranila abaixo de cada grade e levemente levantando-a até que a grade seja retirada da gota. Para manchar o excesso de solução, toque o laço em um ângulo de cerca de 60 graus no papel de filtro sem fiapos e arraste-o lentamente ao longo do papel até que nenhuma outra solução seja absorvida. Coloque o laço com a grade em um rack adequado e deixe secar em temperatura ambiente por mais de 10 minutos.
Use a visão geral obtida pela microscopia de luz para localizar uma região de interesse para aquisição de imagens no microscópio eletrônico de transmissão ou MET e anote a ROI no conjunto de dados de microscopia de luz. Depois que uma região for selecionada, obtenha um bloco de imagem definido com ampliação de 20.000x a 50.000x no MET. Reconstrua o conjunto de blocos de imagem no software de pós-processamento.
Realizar a correlação baseada no sinal DAPI e fluorescência e contornos nucleares em microscopia eletrônica. Mude as imagens para sobrepô-las com precisão e execute a correlação manual com precisão. As células HEPG2 derivadas do hepatoblastoma permaneceram sem necessidade por duas horas em EBSS antes da fixação com paraldeído a 4% por duas horas.
A imagem de LA de CL3 e LAMP1 em cortes revela relativamente poucos pontos de CL3 e pouca colocalização com LAMP1. A informação molecular do FI foi ligada à informação ultra-estrutural obtida em microscopia eletrônica pela sobreposição das duas modalidades de imagem baseadas em DAPI e contornos nucleares. A correlação das organelas CL3 positivas com a ultraestrutura EM revelou que os diferentes pontos representaram estágios distintos de autofagia.
A ultraestrutura dos compartimentos individuais marcados com LC3, como exemplificado pela caixa um, é mostrada aqui. As imagens de microscopia eletrônica de luz correlativa são mostradas à esquerda, e as imagens de microscopia eletrônica pseudocolorida são mostradas à direita. As membranas autofagossomal interna e externa são indicadas por pontas de setas brancas e pretas.
Curiosamente, o EM identificou pontos fluorescentes relativamente fracos como autolisossomos LC3 positivos, que são caracterizados por conteúdo denso e vesículas intraluminais. Isso revela visibilidade mínima de LC3 no FI de seções criométricas ultrafinas, sugerindo CL3 detectável em autolisossomos de estado estacionário, apesar do ambiente degradativo. No entanto, os pontos positivos para LC3 representam principalmente autofagossomos com poucos representando autolisossomos.
Para os pesquisadores que querem fazer a marcação do immunogold em vez do CLEM na seção, os protocolos e dicas descritos aqui são totalmente aplicáveis para a marcação do immunogold também. Inicialmente aplicamos CLEM em secção em proteínas reguladoras endossômicas de baixa abundância e mostramos, pela primeira vez, sua localização endógena ultraestrutural.
