Локализация белков в контексте ультраструктуры клетки была мощным исследовательским инструментом на протяжении десятилетий. С помощью этого протокола мы расширили количество белков, которые имеют низкую распространенность или которые трудно найти. Мы используем флуоресцентную микроскопию для мечения белков чувствительным и экранируемым способом и комбинируем ее с электронной микроскопией для восполнения ультраструктуры клетки.
Здесь мы продемонстрируем CLEM на белках аутофагии, но он действительно может быть применен к любому биологическому вопросу, где представляет интерес ультраструктура клетки, особенно при изучении редких событий. Вместе со мной эту процедуру будет демонстрировать Тинеке Венендал, старший научный сотрудник нашей лаборатории. Для начала замените PBS, содержащий 0,15% глицина, на 1% желатин в PBS, предварительно подогретый до 37 градусов Цельсия.
Соскребите и перенесите клетки в желатине в микроцентрифужную пробирку. Гранулируйте клетки при 6 000 G в течение одной минуты при комнатной температуре в микроцентрифуге, а затем удалите желатин, не повредив гранулу. Добавьте в гранулу 12%-ный желатин, нагретый до 37 градусов Цельсия, и осторожно ресуспендируйте путем пипетирования наконечниками пипеток или стеклянными пастбищными пипетками, предварительно нагретыми до той же температуры.
Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем гранулируйте клетки при температуре 6 000 г в течение одной минуты. Затвердевайте желатин на льду в течение 30 минут. Чтобы удалить желатиновые ячейки из трубки, отрежьте конец трубки, содержащий гранулу, от остальной части трубки лезвием бритвы.
Затем разрежьте конец трубки с клеточной гранулой пополам перпендикулярно первому срезу. Поместите две половинки концов трубки, содержащие клеточную гранулу, в 2,3 молярную сахарозу и инкубируйте в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Это приводит к тому, что половинки клеточных гранул слегка сжимаются и вытесняются из пластиковой трубки.
Извлеките половинки пробирок с гранулами желатина из сахарозы, а затем извлеките половинки клеточных гранул из половинок пластиковой трубки пинцетом. Вручную разрежьте гранулу на блоки подходящего размера лезвием бритвы и используйте стереоанализирующий микроскоп, чтобы увеличить объект во время резки. Инкубируйте клеточные блоки в течение ночи в 2,3 молярной сахарозе при температуре четыре градуса Цельсия.
Поместите их на алюминиевый штифт держателя образца. Оставьте достаточное количество сахарозы по краям блока, чтобы она образовала тонкий хомут между блоком и штифтом. Заморозьте и храните в жидком азоте.
Обрежьте переднюю часть блока, чтобы сгладить его поверхность, чтобы получить участки толщиной около 250 нанометров. Затем обрежьте боковые стороны блока, сделав надрез от 50 до 100 микрометров в боковой части поверхности образца блока с помощью угла ножа. Обрезка четырех сторон грани блока образца создаст выступающий прямоугольник размером примерно 250 на 375 микрометров.
Отрежьте ленту от выступающего прямоугольника, убедившись, что отрезки имеют толщину от 70 до 90 нанометров и серебристо-золотистый блеск. Отведите срезы от края алмазного ножа с помощью волоска на палочке, чтобы получилась длинная лента. Поднимите ленту, окунув трехмиллиметровую петлю захвата в смесь 2,3 молярной сахарозы и 2% метилцеллюлозы в соотношении один к одному.
Вставьте петлю в криокамеру микротома, и как только капля начнет замерзать, быстро подберите срезы, осторожно прижимая к ним каплю. Извлеките петлю из криокамеры. Дождитесь, пока капля полностью оттает и прижмите каплю на подготовленную сетку.
Поместите решетки с секциями примерно на один миллилитр PBS в небольшую посуду или многолуночную тарелку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Обработайте сетки примерно на 75 микролитрах капель на Parafilm и начните с промывки глицином PBS при комнатной температуре. Инкубируют сетки с блокирующим буфером, состоящим из 0,1% бычьего сывороточного альбумина С и 0,5% желатина рыбьей кожи в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре в качестве стадии блокировки.
Разведите первичные антитела в блокирующем буфере в PBS и инкубируйте сетки примерно на 10 микролитровых каплях этого раствора в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте решетки в 0,1%-ном бычьем сывороточном альбумине в PBS пять раз при комнатной температуре. Разбавляют вторичные антитела и DAPI в блокирующем буфере в PBS.
Затем инкубируйте решетки примерно на 10 микролитровых каплях этого раствора в течение 30 минут или дольше при комнатной температуре, прежде чем промыть решетки в PBS пять раз, как показано ранее. Чтобы смонтировать образцы для световой микроскопии, дважды погрузите решетки в 50%-ный глицерин в дистиллированную воду на пять минут при комнатной температуре. Поместите одну сетку на каждый покровный лист между предметным стеклом и защитным стеклом с 50%-ным глицерином, убедившись, что секции обращены к защитному стекле.
Для световой микроскопии возьмите предметное стекло с многослойными сетками в широкопольный микроскоп с автоматическим столиком. Выберите масляный объектив с большим увеличением и создайте набор фрагментов изображения из ленты разделов. Затем для снятия и электронной микроскопии или электромагнитного контрастирования добавьте 10 микролитров дистиллированной воды на боковую сторону сэндвича со стеклянной крышкой предметного стекла и подождите, пока капиллярное действие заполнит интерфейс сэндвича со стеклянной крышкой.
Осторожно снимите покровное стекло, не смешивая погружное масло с глицерином. Извлеките решетки пинцетом и трижды погрузите их в дистиллированную воду комнатной температуры, чтобы смыть 50% глицерина. Осторожно высушите тыльную сторону сетки безворсовой папиросной бумагой и положите сетку стороной вниз на капли дистиллированной воды.
Чтобы окрасить срезы для контрастирования в электронной микроскопии, инкубируйте их с уранилацетатом в течение пяти минут при комнатной температуре. Охладите раствор метилцеллюлозы уранилацетата, поместив капли на Парапленку на металлическую пластину на льду. Затем дважды промойте решетки этим ледяным раствором и выдержите их в растворе в течение 10 минут.
Удалите сетки, вставив петлю сушки сетки в каплю метилцеллюлозы уранилацетата под каждой сеткой и осторожно приподняв ее, пока сетка не снимется с капли. Чтобы промокнуть излишки раствора, прикоснитесь петлей под углом около 60 градусов к безворсовой фильтровальной бумаге и медленно проведите ею по бумаге, пока раствор не перестанет впитываться. Поместите петлю с сеткой на подходящую решетку и дайте ей высохнуть при комнатной температуре более 10 минут.
Используйте обзор, полученный с помощью световой микроскопии, чтобы найти интересующую область для визуализации в просвечивающем электронном микроскопе или ПЭМ, и аннотировать ROI в наборе данных световой микроскопии. После того, как регион выбран, получите фрагмент изображения с увеличением от 20 000x до 50 000x в TEM. Восстановите набор плиток изображения в программном обеспечении для постобработки.
Выполните корреляцию на основе сигнала DAPI и флуоресцентных и ядерных контуров в электронной микроскопии. Смещайте изображения, чтобы точно накладывать их друг на друга, и точно выполняйте ручную корреляцию. Клетки HEPG2, полученные из гепатобластомы, голодали в течение двух часов в EBSS перед фиксацией 4%-ным паральдегидом в течение двух часов.
Визуализация IF LC3 и LAMP1 на срезах выявляет относительно небольшое количество LC3 puncta и небольшую колокализацию с LAMP1. Молекулярная информация, полученная с помощью IF, была связана с ультраструктурной информацией, полученной в электронной микроскопии, путем наложения двух модальностей визуализации, основанных на DAPI и ядерных контурах. Корреляция LC3-положительных органелл с ультраструктурой ЭМ показала, что различные пункты представляют собой различные стадии аутофагии.
Ультраструктура отдельных отсеков, помеченных LC3, как показано на рисунке 1, показана здесь. Изображения коррелятивной световой электронной микроскопии показаны слева, а изображения псевдоцветной электронной микроскопии — справа. Внутренние и наружные аутофагосомные мембраны обозначены белыми и черными наконечниками стрелок.
Интересно, что ЭМ идентифицировала относительно слабые флуоресцентные пятна как LC3-позитивные аутолизосомы, которые характеризуются плотным содержимым и внутрипросветными везикулами. Это показывает минимальную видимость LC3 в ПЧ ультратонких криосекций, что позволяет предположить, что LC3 обнаруживается в стационарных аутолизосомах, несмотря на деградационную среду. Тем не менее, LC3-положительные пункты в основном представляют аутофагосомы, и лишь немногие представляют аутолизосомы.
Для исследователей, которые хотят делать маркировку иммунозолотом, а не CLEM на срезе, протоколы и советы, описанные здесь, полностью применимы и для мечения иммунозолотом. Первоначально мы применили on-section CLEM к эндосомальным регуляторным белкам низкой распространенности и впервые показали их эндогенную ультраструктурную локализацию.
