細胞の超微細構造におけるタンパク質の局在化は、何十年にもわたって強力な研究ツールとなってきました。このプロトコルでは、存在量が少ないタンパク質や見つけにくいタンパク質を拡張しました。蛍光顕微鏡を用いて、高感度でスクリーニング可能な方法でタンパク質を標識し、電子顕微鏡と組み合わせて細胞の超微細構造を補充します。
ここでは、オートファジータンパク質のオンセクションCLEMを実証しますが、細胞の超微細構造が関心のある生物学的問題、特にまれな事象の研究に実際に適用できます。私と一緒に手順を実演するのは、私たちの研究室の上級研究技術者であるTineke Veenendaalです。まず、0.15%グリシンを含むPBSを、摂氏37度に予熱したPBS中の1%ゼラチンと交換します。
ゼラチン中の細胞をこすり落とし、微量遠心チューブに移します。微量遠心分離機で室温で1分間6、000Gで細胞をペレット化し、ペレットを乱すことなくゼラチンを除去します。摂氏37度に加温した12%ゼラチンをペレットに加え、ピペットチップまたは同じ温度に予熱したガラス製牧草地ピペットでピペッティングして穏やかに再懸濁します。
摂氏37度で10分間インキュベートした後、細胞を6, 000 Gで1分間ペレット化します。ゼラチンを氷上で30分間固めます。ゼラチン包埋細胞をチューブから取り除くには、ペレットを含むチューブの端をチューブの残りの部分からカミソリの刃で切り取ります。
次に、セルペレットでチューブの端を最初のカットに対して垂直に半分にカットします。細胞ペレットを含む2つのチューブの端半分を2.3モルのスクロースに入れ、摂氏4度で10分間インキュベートします。これにより、細胞ペレットの半分がわずかに収縮し、プラスチックチューブから外れます。
ゼラチンが埋め込まれた細胞ペレットが入ったチューブの半分をスクロースから取り除き、次にピンセットでプラスチックチューブの半分から細胞ペレットの半分を取り除きます。ペレットをカミソリの刃で適切なサイズのブロックに手動で切断し、実体解剖顕微鏡を使用して切断中に被写体を拡大します。細胞ブロックを2.3モルのスクロース中で摂氏4度で一晩インキュベートします。
アルミニウム製サンプルホルダーピンに取り付けます。ブロックとピンの間に薄いカラーを形成するように、ブロックの端に十分なスクロースを残します。スナップフリーズして液体窒素で保存します。
ブロックの前面をトリミングして表面を平らにし、約250ナノメートルの厚さのセクションを取得します。次に、ナイフの角でサンプルブロック面の側面に50〜100マイクロメートルを切断して、ブロックの側面をトリミングします。サンプルブロック面の4辺をトリミングすると、約250 x 375マイクロメートルの長方形が突き出ます。
突き出た長方形からリボンを切断し、セクションの厚さが70〜90ナノメートルで、銀色の金色の光沢があることを確認します。ダイヤモンドナイフの刃から切片を棒につなげて、長いリボンを作ります。3ミリメートルのピックアップループを2.3モルのスクロースと2%メチルセルロースの1対1の混合物に浸して、リボンをピックアップします。
ループをミクロトームのクライオチャンバーに挿入し、液滴が固まり始めたら、液滴をそっと押し付けて切片をすぐに拾います。クライオチャンバーからループを取り外します。液滴が完全に解凍するまで待ち、準備したグリッドに液滴を押します。
約1ミリリットルのPBSを切片化したグリッドを小皿またはマルチウェルプレートに入れ、摂氏37度で30分間インキュベートします。パラフィルム上の約75マイクロリットルの液滴でグリッドを処理し、室温でPBSグリシン洗浄から始めます。ブロッキングステップとして、0.1%ウシ血清アルブミンCおよび0.5%魚皮ゼラチンからなるブロッキングバッファーをPBS中で室温で10分間インキュベートします。
一次抗体をブロッキングバッファーでPBSに希釈し、この溶液の約10マイクロリットルの液滴上で室温で1時間インキュベートします。0.1%ウシ血清アルブミン含有PBS溶液中のグリッドを室温で5回洗浄します。二次抗体とDAPIをPBSのブロッキングバッファーで希釈します。
次に、この溶液の約10マイクロリットルの液滴でグリッドを室温で30分以上インキュベートした後、前述のようにPBSでグリッドを5回洗浄します。光学顕微鏡用のサンプルを取り付けるには、グリッドを蒸留水に溶かした50%グリセロールに2回、室温で5分間浸します。50%グリセロールのスライドガラスとカバースリップの間にカバースリップごとに1つのグリッドを配置し、セクションがカバーガラスに面するようにします。
光学顕微鏡では、グリッドを挟んだスライドガラスを自動ステージ付きの広視野顕微鏡に持っていきます。高倍率のオイル対物レンズを選択し、セクションのリボンの画像タイルセットを作成します。次に、アンマウントと電子顕微鏡またはEMコントラストのために、スライドガラスカバースリップサンドイッチの側面に10マイクロリットルの蒸留水を追加し、毛細管現象がガラスカバースリップサンドイッチ界面を満たすのを待ちます。
グリセロールに浸漬油を混ぜずにカバースリップを慎重に取り外します。ピンセットでグリッドを回収し、室温で蒸留水に3回浸して、50%グリセロールを洗い流します。糸くずの出ないティッシュペーパーでグリッドの裏側を慎重に乾かし、グリッドセクションを下にして蒸留水滴の上に置きます。
電子顕微鏡で造影剤として切片を染色するには、室温で酢酸ウラニルと5分間インキュベートします。酢酸ウラニルメチルセルロース溶液を、氷上の金属板上のパラフィルムに液滴を置いて冷却します。次に、この氷冷溶液でグリッドを2回洗浄し、溶液中で10分間インキュベートします。
グリッド乾燥ループを各グリッドの下の酢酸ウラニルメチルセルロース液滴に挿入し、グリッドが液滴から引き離されるまでゆっくりと持ち上げて、グリッドをループアウトします。余分な溶液を吸い取るには、糸くずの出ないろ紙に約60度の角度でループに触れ、溶液が吸収されなくなるまで紙に沿ってゆっくりとドラッグします。グリッド付きのループを適切なラックに置き、室温で10分以上乾燥させます。
光学顕微鏡で得られた概要を使用して、透過型電子顕微鏡またはTEMでイメージングする関心領域を特定し、光学顕微鏡データセットにROIに注釈を付けます。領域を選択したら、TEMで20, 000倍から50, 000倍の倍率で設定された画像タイルを取得します。後処理ソフトウェアで設定された画像タイルを再構築します。
電子顕微鏡でDAPIシグナルと蛍光および核の輪郭に基づいて相関を実行します。画像をシフトして正確に重ね合わせ、手動の相関関係を正確に実行します。肝芽腫由来のHEPG2細胞をEBSSで2時間飢餓状態にした後、4%パラアルデヒドで2時間固定した。
切片上のLC3とLAMP1のIFイメージングでは、LC3の点点が比較的少なく、LAMP1との共局在がほとんど見られません。IFの分子情報は、DAPIと核外形に基づく2つのイメージングモダリティを重ね合わせることで、電子顕微鏡で得られた超微細構造情報とリンクしました。LC3陽性細胞小器官とEM超微細構造の相関関係から、異なる点状がオートファジーの異なる段階を表していることが明らかになりました。
ボックス 1 で例示されている個々の LC3 標識コンパートメントの超微細構造をここに示します。左に相関光電子顕微鏡像、右に疑似着色電子顕微鏡像を示す。内側と外側のオートファゴソーム膜は、白と黒の矢印で示されます。
興味深いことに、EMは比較的弱い蛍光斑をLC3陽性オートリソソームとして同定し、この自己リソソームは濃密な内容物と管腔内小胞を特徴としています。これにより、極薄クライオ切片のIFではLC3の視認性が最小限に抑えられていることが明らかになり、分解環境にもかかわらず定常状態のオートリソソームでLC3が検出可能であることが示唆されました。しかし、LC3陽性の点状は主にオートファゴソームを表し、オートリソソームを表すものはほとんどありません。
オンセクションCLEMの代わりにイムノゴールドラベリングを行いたい研究者のために、ここで説明するプロトコルとヒントは、イムノゴールドラベリングにも完全に適用できます。我々はまず、少量のエンドソーム制御タンパク質にオンセクションCLEMを適用し、その内因性超微細構造局在を初めて示しました。
