לוקליזציה של חלבונים בהקשר של מבנה העל של התא הייתה כלי מחקר רב עוצמה במשך עשרות שנים. בעזרת פרוטוקול זה הרחבנו את החלבונים שהם דלי שפע או קשים לאיתור. אנו משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסמן חלבונים באופן רגיש וניתן לסינון ומשלבים אותו עם מיקרוסקופ אלקטרונים כדי למלא מחדש את מבנה העל של התא.
כאן נדגים בפרק CLEM על חלבוני אוטופגיה, אבל זה באמת יכול להיות מיושם על כל שאלה ביולוגית שבה מבנה העל של התא הוא מעניין, במיוחד בחקר אירועים נדירים. מי שתדגים איתי את ההליך תהיה טינקה ויננדאל, טכנאית מחקר בכירה מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, להחליף את PBS המכיל 0.15% גליצין עם 1% ג'לטין PBS שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
מגרדים ומעבירים את התאים בג'לטין לצינור מיקרוצנטריפוגה. גלולה התאים ב 6, 000 גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן להסיר את הג'לטין מבלי להפריע את הכדור. מוסיפים לגלולה 12% ג'לטין שחומם ל-37 מעלות צלזיוס ומשהים מחדש בעדינות על ידי פיפטה עם קצוות פיפטה או פיפטות מרעה מזכוכית שחוממו מראש לאותה טמפרטורה.
לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן pellet את התאים ב 6, 000 גרם במשך דקה אחת. ממצקים את הג'לטין על קרח למשך 30 דקות. כדי להסיר את התאים המשובצים בג'לטין מהצינור, חתכו את קצה הצינור המכיל את הגלולה משאר הצינור בעזרת סכין גילוח.
לאחר מכן חותכים את קצה הצינור עם גלולת התא בניצב למחצה לחתך הראשון. מניחים את שני חצאי קצה הצינור המכילים את גלולת התא בסוכרוז טוחנת 2.3 ודגרים במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. זה גורם לחצאי כדורי התא להתכווץ מעט ולהתנתק מצינור הפלסטיק.
הסר את חצאי הצינור עם גלולת התא המשובצת בג'לטין מהסוכרוז, ולאחר מכן הסר את חצאי גלולות התא מחצאי צינור הפלסטיק בפינצטה. חתכו ידנית את הגלולה לגושים בגודל מתאים עם סכין גילוח, והשתמשו במיקרוסקופ מנתח סטריאו כדי להגדיל את הנושא במהלך החיתוך. דוגרים על גושי התא למשך הלילה בסוכרוז מולארי 2.3 בארבע מעלות צלזיוס.
הניחו אותם על סיכת מחזיק דגימת אלומיניום. השאירו מספיק סוכרוז סביב שולי הבלוק כך שהוא יוצר צווארון דק בין הבלוק לסיכה. הצמד להקפיא ולאחסן אותו בחנקן נוזלי.
חתוך את חזית הבלוק כדי לשטח את פני השטח שלו לקבלת חלקים בעובי של כ -250 ננומטר. לאחר מכן חותכים את צידי הבלוק על ידי חתך 50 עד 100 מיקרומטר לצד פני גוש הדגימה עם פינת הסכין. חיתוך ארבעה צדדים של פני גוש הדגימה ייצור מלבן בולט סביב 250 על 375 מיקרומטר.
חתך סרט מהמלבן הבולט המבטיח שהקטעים יהיו בעובי של בין 70 ל -90 ננומטר ובעלי ברק זהוב כסוף. הרחיקו את החלקים מקצה סכין היהלומים בעזרת שערה על מקל ליצירת סרט ארוך. הרימו את הסרט על ידי טבילת לולאת האיסוף של שלושה מילימטרים בתערובת של אחד לאחד של 2.3 סוכרוז מולארי ו-2% מתילצלולוז.
הכנס את הלולאה לתוך תא ההקפאה של המיקרוטום, וברגע שהטיפה מתחילה לקפוא, הרימו מיד את החלקים על ידי לחיצה עדינה על הטיפה נגדם. הסר את הלולאה מתא ההקפאה. המתן עד שהטיפה הפשירה לחלוטין ולחץ על הטיפה על רשת מוכנה.
מניחים את הרשתות עם מקטעים על כמיליליטר אחד של PBS בצלחת קטנה או צלחת מרובת בארות ודגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מעבדים את הרשתות על כ-75 מיקרוליטר טיפות על פרפילם ומתחילים עם שטיפות גליצין PBS בטמפרטורת החדר. יש לדגור על הרשתות עם חיץ חוסם העשוי מאלבומין C בסרום בקר 0.1% וג'לטין עור דגים 0.5% ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כשלב החסימה.
לדלל נוגדנים ראשוניים בחיץ חוסם ב- PBS ולדגור על הרשתות על כ -10 טיפות מיקרוליטר של תמיסה זו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את הרשתות באלבומין בסרום בקר 0.1% ב-PBS חמש פעמים בטמפרטורת החדר. לדלל את הנוגדנים המשניים ואת DAPI במאגר החוסם ב- PBS.
לאחר מכן יש לדגור על הרשתות על כ-10 טיפות מיקרוליטר של תמיסה זו למשך 30 דקות או יותר בטמפרטורת החדר לפני ששוטפים את הרשתות ב-PBS חמש פעמים כפי שהוצג קודם לכן. כדי להרכיב את הדגימות למיקרוסקופ אור, השקיעו את הרשתות ב-50% גליצרול במים מזוקקים פעמיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הניחו רשת אחת לכל החלקת כיסוי בין מגלשת זכוכית להחלקת כיסוי בגליצרול של 50%, וודאו שהחלקים פונים לחלקת הכיסוי.
למיקרוסקופ אור, קחו שקופית זכוכית עם הרשתות הדחוקות למיקרוסקופ שדה רחב עם שלב אוטומטי. בחר מטרת שמן בהגדלה גבוהה וצור ערכת אריחים של רצועת הכלים של המקטעים. לאחר מכן, לפירוק ומיקרוסקופ אלקטרונים או ניגודיות EM, הוסף 10 מיקרוליטר מים מזוקקים לצד כריך ההחלקה של כיסוי מגלשת הזכוכית, והמתן לפעולה נימית כדי למלא את ממשק כריך החלקה של כיסוי זכוכית.
יש להסיר בזהירות את חלקת הכיסוי מבלי לערבב שמן טבילה עם הגליצרול. שלפו את הרשתות בפינצטה והטבילו אותן במים מזוקקים שלוש פעמים בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את הגליצרול 50%. יבשו בזהירות את גב הרשת עם נייר טישו נטול סיבים והניחו את מקטע הרשת בצד על טיפות מים מזוקקות.
כדי להכתים את החלקים לניגוד במיקרוסקופ אלקטרונים, לדגור אותם עם אורניל אצטט במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מצננים את תמיסת האורניל אצטט מתילצלולוז על ידי הנחת הטיפות על פרפילם על צלחת מתכת על קרח. לאחר מכן לשטוף את הרשתות עם פתרון קר כקרח זה פעמיים לדגור אותם בתמיסה במשך 10 דקות.
לולאת החוצה את הרשתות על ידי הכנסת לולאת ייבוש רשת לתוך טיפת אורניל אצטט מתילצלולוז מתחת לכל רשת והרים אותה בעדינות עד שהרשת נשלפת מהטיפה. כדי להכתים את התמיסה העודפת, גע בלולאה בזווית של כ-60 מעלות על נייר הסינון ללא סיבים וגרור אותה באיטיות לאורך הנייר עד שלא תיספג תמיסה נוספת. הניחו את הלולאה עם הרשת במדף מתאים, והניחו לה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך יותר מ-10 דקות.
השתמש בסקירה המתקבלת במיקרוסקופ אור כדי לאתר אזור עניין להדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים שידור או TEM, וציין את החזר ההשקעה על מערך הנתונים של מיקרוסקופ האור. לאחר בחירת אזור, קבל אריח תמונה שנקבע בהגדלה של 20, 000x עד 50, 000x ב- TEM. בנה מחדש את ערכת אריח התמונה בתוכנה שלאחר עיבוד.
בצע את המתאם בהתבסס על אות DAPI וקווי מתאר פלואורסצנטיים וגרעיניים במיקרוסקופ אלקטרונים. הזיזו את התמונות כדי לכסות אותן במדויק ובצעו את ההתאמה הידנית במדויק. תאי HEPG2 שמקורם בהפטובלסטומה הורעבו במשך שעתיים ב- EBSS לפני הקיבוע עם 4% פראלדהיד למשך שעתיים.
הדמיית IF של LC3 ו-LAMP1 במקטעים חושפת יחסית מעט LC3 puncta ומעט לוקליזציה עם LAMP1. מידע מולקולרי מ-IF קושר למידע אולטרה-מבני שהתקבל במיקרוסקופ אלקטרונים על ידי כיסוי שני אופני הדימות המבוססים על DAPI וקווי מתאר גרעיניים. המתאם בין אברונים חיוביים LC3 לאולטרה-מבנה EM גילה כי הפונקטה השונים מייצגים שלבים נפרדים של אוטופגיה.
מבנה העל של התאים המסומנים ב-LC3 כפי שמודגם בתיבה הראשונה מוצג כאן. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים אור מתאמי מוצגות משמאל, ותמונות מיקרוסקופ אלקטרונים צבעוני מדומה מוצגות מימין. קרומים אוטופגוזומליים פנימיים וחיצוניים מסומנים על ידי ראשי חץ לבנים ושחורים.
באופן מעניין, EM זיהה כתמים פלואורסצנטיים חלשים יחסית כמו אוטוליזוזומים חיוביים LC3, המאופיינים בתוכן צפוף ובועיות intraluminal. זה חושף ראות LC3 מינימלית ב- IF של קטעי קריו דקים במיוחד, מה שמרמז על LC3 ניתן לזיהוי במצב אוטוליזוזומים במצב יציב למרות הסביבה המתכלה. עם זאת, פונקטה חיובית LC3 מייצגת בעיקר אוטופגוזומים ומעטים מייצגים אוטוליזוזומים.
עבור חוקרים שרוצים לבצע תיוג אימונוגולד במקום CLEM על סעיף, הפרוטוקולים והטיפים המתוארים כאן ישימים במלואם גם עבור תיוג אימונוגולד. בתחילה יישמנו CLEM בחתך על חלבונים אנדוזומליים רגולטוריים בעלי שפע נמוך והראינו לראשונה את הלוקליזציה האולטרה-מבנית האנדוגנית שלהם.
