توضح هذه التقنية طريقة قابلة للتكرار لعزل الخلايا الظهارية الموجودة في الدم ونخاع العظام للأفراد الأصحاء لاستخدامها في مزيد من التحليل النهائي. تسمح هذه التقنية بعزل الخلايا الظهارية بجزء بسيط من تكلفة عزل الخلايا السرطانية المنتشرة تلقائيا بسبب إمكانية الوصول إلى قياس التدفق الخلوي. يمكن أن يكون لهذه الطريقة آثار في بيولوجيا الخلايا الجذعية والتنموية والعلاجات التجديدية.
يمكن استخدامه أيضا لدراسة التئام الجروح وصيانة الأنسجة في الأنسجة الظهارية. العظام صغيرة جدا وهشة ، لذا تعامل معها بحذر لمنع التقاط العظام أو فقدانها. نخاع العظم مستقر نسبيا ، لذا يمكنك العمل ببطء وبعناية لضمان الحصاد المناسب.
للبدء ، ضع الماوس في وعاء سعة 500 ملليلتر وأضف ما يكفي من اليود لتغطية نصف الماوس. هز الحاوية برفق وقم بتدويرها لضمان تغطية شاملة. ثم شطف بالماء منزوع الأيونات.
قم بإجراء غسل واحد آخر باليود ثم غسلتين بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع الماوس في غطاء وضعه على ظهره على الدرج. أمسك الساقين الخلفيتين واسحبهما بعيدا حتى تشعر بفرقعة.
قم بعمل شق سنتيمتر واحد على جلد الفأر بالقرب من منطقة الفخذ. أدخل مقصا مغلقا في الشق وافتح المقص تحت الجلد لفصله عن الصفاق. قطع الجلد على الساق حول الفخذ ، ثم قطع الجلد أسفل الساق لفضح العضلات والعظام.
قبل قطع الساق الخلفية ، قم بجس عظم الورك لتوجيه المقص بدقة ومنع الجروح في عظم الفخذ حيث يوجد معظم نخاع العظم. ثم قم بإزالة الأرجل الخلفية عن طريق قطع مفصل الورك دون قطع عظم الفخذ. ضع الأطراف في أنبوب مكتوب عليه أطراف.
بعد ذلك ، قم بإزالة العضلات والأنسجة والدهون على طول أحد الأطراف عن طريق القطع بالتوازي مع العظم باستخدام المقص. ثم استخدم مشرطا لإزالة أي دهون أو عضلات متبقية بعناية عن طريق إجراء حركة كشط عمودية على العظام. بعد تنظيف العظم بشكل صحيح ، افصل عظم الفخذ والساق عند الركبة.
ثم استخدم مشرطا لعمل جروح على طرفي عظم الفخذ والساق حيث لا يوجد نخاع عظمي مرئي. أدخل المحقنة والإبرة المعدة مسبقا في العظم. إذا كانت هناك مقاومة ، فقم بقص نهاية العظم حتى لا تواجه المزيد من المقاومة.
أمسك العظم بإحكام فوق الأنبوب المسمى نخاع العظم وحقن محلول حصاد نخاع العظم في العظم. ثم استحى من نخاع العظم في الأنبوب. كرر ذلك مع الطرف الآخر من العظم لجمع بقية نخاع العظم حتى يظهر العظم أبيض تماما أو فارغا.
باستخدام حقنة فارغة سعة 10 ملليلتر وإبرة 20 جرام ، قم بكسر كتل نخاع العظم في الأنبوب عن طريق سحب نخاع العظم لأعلى ولأسفل في المحقنة من خمس إلى 10 مرات. أضف مرشح 40 ميكرون إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 ملليلتر وشطفه بملليلتر واحد من محلول حصاد نخاع العظام. قم بتصفية نخاع العظم من خلال المرشح لإزالة أي كتل متبقية.
ثم قم بتسمية نخاع العظم المصفى بالأنبوب. قم بتخزين نخاع العظم المصفى في الثلاجة أو على الثلج حتى استخدامه في نفس اليوم. أجهزة الطرد المركزي خلايا نخاع العظم في 170G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
نظف بالمكنسة الكهربائية وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من واحد × مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء واحتضانها لمدة أربع دقائق. ثم أضف 30 ملليلترا من محلول ملحي مخزن بالفوسفات في Dulbecco لإيقاف تفاعل محلول التحلل.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة ثماني دقائق في 170G في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليقها في 10 إلى 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. أولا ، قسم الخلايا إلى أنابيب مصنفة بشكل فردي بناء على لوحة التلوين المستخدمة ، بما في ذلك ضوابط التعويض.
قم بإعداد عناصر تحكم غير ملوثة وأدوات تحكم في النظائر لمنع تلطيخ غير محدد. لكل أربعة فلورا ، أضف تحكما واحدا في البقع وأضف أيضا عناصر تحكم مضان ناقص عنصر تحكم واحد مع أربعة فلورا المتبقية. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة وفقا للتخفيف الموصى به واخلطها جيدا عن طريق تحريك الجزء السفلي من الأنابيب.
يفضل استخدام EpCAM مترافق مع Phycoerythrin لتصور عدد منخفض من الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. بعد الحضانة ، أحضر الأنابيب إلى غطاء BSL وأضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتلطيخ إلى كل أنبوب.
ثم أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 170G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، أحضر الأنابيب المغطاة إلى غطاء محرك السيارة BSL واستنشق المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتلطيخ ونفض الغبار عن قاع الأنابيب للخلط.
كرر الغسيل والطرد المركزي مرتين أخريين. أخيرا ، أعد تعليق الحنك في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين قبل قياس التدفق الخلوي. أضف DAPI أو مميز الخلايا الميتة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
باستخدام هذا البروتوكول ، تم تصور مجموعات نادرة من الخلايا الظهارية في نخاع العظام للفئران. كانت أربعة إلى 5٪ من الخلايا في نخاع عظم الفئران إيجابية EpCAM ، بغض النظر عن عدد الخلايا التي تم عدها. في عينات نخاع العظم البشري ، كانت 2 إلى 5٪ من الخلايا إيجابية EpCAM.
أيضا ، كانت النسبة المئوية للخلايا داخل كل متبرع فردي متسقة حيث تم حساب المزيد من الخلايا بشكل تدريجي. في عينات دم الفئران ، كان أقل من 0.5٪ من الخلايا إيجابية EpCAM. بينما في عينات الدم البشري كان هذا الرقم حوالي 0.3 ٪ من الخلايا.
أظهرت عينات التحكم عددا قليلا جدا من الخلايا الإيجابية EpCAM الإيجابية الكاذبة. علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا التي تم فرزها في المجموعة الإيجابية EpCAM تلطيخا لعموم السيتوكيراتين. في حين أن أولئك من المجموعة السلبية EpCAM لم يظهروا إشارة السيتوكيراتين.
من المهم للغاية الحفاظ على بيئة نظيفة ومعقمة. هذا سيمنع أي تلوث للعينة. هناك العديد من التطبيقات النهائية التي يمكن استخدامها على الخلايا الطلائية المعزولة لتحديد وظيفتها.
وتشمل هذه تسلسل الحمض النووي الريبي ، وزراعة الخلايا في تجارب الجسم الحي ، والفحص المجهري المناعي.
