يوفر هذا البروتوكول معرفة عملية مفيدة لصياغة الجسيمات النانوية ، أي الأقراص النانوية ، التي تتضمن بثبات مجموعة واسعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا الكارهة للماء. هذه الطريقة لها العديد من التطبيقات العملية.
تسمح القدرة على منح الذوبان المائي للمركبات النشطة بيولوجيا غير القابلة للذوبان باستخدام الأقراص النانوية في تطبيقات توصيل الأدوية. الطريقة الموصوفة واضحة. يفضل إجراء دراسات على المقياس الموصوف ، خمسة ملليغرام من الفوسفوليبيد ، واثنين من ملليغرام من بروتين السقالة ، بحيث يتم مراقبة تكوين الأقراص النانوية بسهولة عن طريق الفحص البصري.
سيوضح الإجراء مايكل كارو وماثيو سواكهامر ، باحثان من الطلاب الجامعيين في مختبر ريان. لتحضير حصص الفوسفوليبيد ، قم بوزن خمسة ملليجرامات من DMPC وانقله إلى أنبوب اختبار زجاجي. قم بإذابة الفوسفوليبيد بإضافة 300 ميكرولتر من الكلوروفورم و100 ميكرولتر من الميثانول بنسبة ثلاثة إلى واحد.
تبخر المذيب العضوي عن طريق وضع أنبوب الاختبار الزجاجي تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، بحيث يتشكل طبقة رقيقة من الفوسفوليبيد المجفف على طول جدران الجزء السفلي من الأنبوب. لصياغة الأمفوتريسين B أو AmpB-Nanodisks ، ماصة 450 ميكرولتر من PBS إلى حصص الفوسفوليبيد المجففة بالتجميد ، والدوامة لمدة 30 ثانية لتفريق الدهون. ماصة 50 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل ملليلتر مخزون محلول AmpB في عينة الفوسفوليبيد المشتتة والدوامة.
أضف 500 ميكرولتر من أربعة ملليغرام لكل ملليلتر بروتين سقالة ApoE4 NT إلى أنبوب الاختبار الزجاجي الذي يحتوي على الفوسفوليبيد المشتت و AmpB. حمام صوتنة العينة عند 24 درجة مئوية حتى يتضح المحلول. لغسيل الكلى AmpB-Nanodisk ، قم بإعداد قسم من أنابيب غسيل الكلى عن طريق نقعه جيدا في الماء مقطر منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق.
باستخدام مشبك أنابيب غسيل الكلى ، قم بتثبيت أحد طرفي أنبوب غسيل الكلى المنقوع ، مما يضمن عدم خروج أي سائل. أدخل قمع عنق ضيق في الطرف المفتوح لأنبوب غسيل الكلى وانقل عينة AmpB-Nanodisk إلى أنبوب غسيل الكلى. قم بإزالة القمع ، وقم بتثبيت نهاية أنبوب غسيل الكلى بمشبك أنبوب غسيل الكلى آخر.
ضع عوامة غسيل الكلى الرغوية على أحد الأطراف المغلقة لأنبوب غسيل الكلى ، وضع أنبوب غسيل الكلى المجمع في الدورق الذي يحتوي على مخزن مؤقت سعة لتر واحد طازج. ضع قضيب تقليب مغناطيسي في قاع الدورق واضبط عنصر التحكم في التحريك على مستوى منخفض ، مع ضمان عدم إنتاج دوامة. اسمح لغسيل الكلى بالاستمرار طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي عن طريق قلب مفتاح الطاقة والاتصال بجهاز كمبيوتر دعم مطابق عن طريق الضغط على التحكم في الكمبيوتر. على كمبيوتر الدعم ، افتح البرنامج المسمى UVProbe 2.61 ، واتصل بمقياس الطيف الضوئي بالنقر فوق اتصال "في الزاوية اليسرى السفلية. انقر فوق الطيف ، ثم انقر فوق الطريقة "في شريط الأدوات العلوي.
انقر فوق علامة التبويب القياس وأدخل 500 في مربع النص "الابتدائي" الموجود ضمن نطاق الطول الموجي ، و 300 في مربع النص "النهاية". انقر فوق القائمة المنسدلة بجوار علامة التبويب المسماة سرعة المسح الضوئي "واضبطها على متوسطة. قم بإعداد عينة فارغة عن طريق نقل ملليلتر واحد من DMSO إلى اثنين من الكوارتز cuvettes.
قم بتحميل كلا الكوفيت في منافذ العينة الخاصة بمقياس الطيف الضوئي. انقر فوق فارغ تلقائي "وسجل طيفا من 300 إلى 500 نانومتر بالنقر فوق ابدأ" في الزاوية اليسرى السفلية. للتحليل الطيفي القياسي AmpB ، قم بإزالة الكوفيت من منفذ العينة الأمامي وأضف 20 ميكرولترا من ملليغرام واحد لكل مليلتر من محلول مخزون AmpB.
قم بتحميل cuvette مرة أخرى في لوحة العينة وانقر فوق "ابدأ" لتسجيل امتصاص العينة. بعد تسجيل امتصاص العينة ، قم بإزالة الكوفيت وصب محتويات السائل في حاوية نفايات. اشطف الكوفيت جيدا بثلاث غسلات من الماء منزوع الأيونات ، تليها ثلاث غسلات بنسبة 70٪ إيثانول.
للتحليل الطيفي لقرص AmpB-Nanodisk المعطل ، قم بإعداد العينة عن طريق سحب 20 ميكرولترا من ملليغرام واحد لكل مليلتر من مخزون AmpB-Nanodisk في ملليلتر واحد من DMSO ، واحتضانها لمدة دقيقة واحدة قبل تسجيل الطيف. قم بتحميل الكوفيت في منفذ العينة الأمامي وانقر فوق ابدأ "لتسجيل امتصاص العينة. للتحليل الطيفي لمخزن مؤقت PBS فارغ ، قم بإعداد فراغ عن طريق نقل ملليلتر واحد من PBS إلى اثنين من الكوارتز cuvettes.
قم بتحميل cuvettes في منفذ العينة. انقر فوق فراغ تلقائي "وسجل الطيف من 300 إلى 500 نانومتر. للتحليل الطيفي لعينة AmpB-Nanodisk غير المعطلة ، قم بإزالة الكوفيت من منفذ العينة الأمامي وأضف 20 ميكرولترا من ملليغرام واحد لكل مليلتر عينة AmpB-Nanodisk في المخزن المؤقت PBS.
قم بتحميل الكوفيت مرة أخرى في لوحة العينة. انقر فوق ابدأ "وسجل طيف العينة. يعتبر تفاعل تركيبة AmpB-Nanodisk مكتملا عندما ينتقل مظهر العينة من العكر إلى الصاف.
يظهر التحليل الطيفي للامتصاص المرئي للأشعة فوق البنفسجية لعينات AmpB في DMSO و PBS. في DMSO ، لوحظت ثلاثة حدود امتصاص مميزة عند 372 و 392 و 415 نانومتر ، وهي قمم تدل على AmpB. أظهرت أطياف الامتصاص لأقراص AmpB-Nanodisks في PBS ذروة امتصاص رئيسية واحدة عند طول موجي أقصر.
وبالمقارنة ، بدت أطياف الامتصاص لأقراص AmpB-Nanodisks في DMSO مشابهة لأطياف المخزون AmpB. تم تنفيذ النشاط البيولوجي لأقراص AmpB-Nanodisks من خلال تقييم مقايسات تثبيط نمو الخميرة. أظهرت عينات التحكم مثل PBS و DMSO والبروتينات الدهنية عالية الكثافة المعاد تشكيلها أن مكونات الأقراص النانوية بخلاف AmpB ليس لها تأثير ملحوظ على نمو الخميرة.
أكدت السيطرة الإيجابية أن AmpB هو مثبط فعال لنمو الخميرة. في حالة AmpB-Nanodisks ، لوحظ نشاط تثبيط النمو المعتمد على التركيز. ليست كل مستحضرات الأقراص النانوية متشابهة.
قد يتطلب البعض مزيدا من الوقت أو دهون مختلفة أو بروتينات سقالة مختلفة. هم فقط غير واضح}هو توضيح عينة القرص النانوي. أدت هذه التقنية إلى جسيمات نانوية جديدة تستخدم لدراسة السمية القلبية التي يسببها دوكسوروبيسين ، وموت الخلايا المبرمج ، وتفاعلات الرباط ، وقدمت العديد من الجزيئات المائية النشطة بيولوجيا غير القابلة للذوبان ، بما في ذلك اللوتين والكركمين.
