Este protocolo fornece conhecimento prático, útil para a formulação de partículas em nanoescala, ou seja, nanodiscos, que incorporam de forma estável uma ampla gama de moléculas bioativas hidrofóbicas. Este método tem muitas aplicações práticas.
A capacidade de conferir solubilidade aquosa a compostos bioativos insolúveis permite o uso de nanodiscos em aplicações de liberação de fármacos. O método descrito é simples. Prefere-se realizar estudos na escala descrita, cinco miligramas de fosfolipídio, dois miligramas de proteína do andaime, para que a formação de nanodiscos seja prontamente monitorada por inspeção visual.
Quem demonstrará o procedimento serão Michael Karo e Matthew Swackhammer, estudantes de graduação pesquisadores do laboratório Ryan. Para preparar uma alíquota fosfolipídica, pese cinco miligramas de DMPC e transfira-o para um tubo de ensaio de vidro. Dissolva o fosfolipídeo adicionando 300 microlitros de clorofórmio e 100 microlitros de metanol para uma proporção de três para um.
Evaporar o solvente orgânico colocando o tubo de ensaio de vidro sob uma corrente suave de gás nitrogênio por 10 a 15 minutos, de modo que uma fina película de fosfolipídio seco se forme ao longo das paredes da porção inferior do tubo. Para formular anfotericina B ou AmpB-Nanodisks, pipetar 450 microlitros de PBS para a alíquota fosfolipídica liofilizada e vórtice por 30 segundos para dispersar o lipídio. Pipetar 50 microlitros de 20 miligramas por mililitro de solução de AmpB de estoque na amostra de fosfolipídios dispersa e vórtice.
Adicionar 500 microlitros de quatro miligramas por mililitro de proteína do arcabouço ApoE4 NT ao tubo de ensaio de vidro contendo o fosfolipídeo disperso e AmpB. Banho sonicar a amostra a 24 graus Celsius até que a solução se esclareça. Para diálise com AmpB-Nanodisk, prepare uma seção de tubo de diálise mergulhando-a completamente em água deionizada destilada por 10 minutos.
Usando uma braçadeira de tubo de diálise, prenda uma extremidade da tubulação de diálise encharcada, garantindo que nenhum líquido possa escapar. Insira um funil de pescoço estreito na extremidade aberta do tubo de diálise e transfira a amostra de AmpB-Nanodisk para o tubo de diálise. Retire o funil e prenda a extremidade do tubo de diálise com outra braçadeira do tubo de diálise.
Coloque um flutuador de diálise de espuma em uma das extremidades seladas do tubo de diálise e coloque o tubo de diálise montado no copo contendo um litro de tampão PBS recém-preparado. Coloque uma barra de agitação magnética no fundo do copo e ajuste o controle de agitação para baixo, garantindo que não produza um vórtice. Permitir que a diálise continue durante a noite a quatro graus Celsius.
Ligue o espectrofotômetro acionando o botão liga/desliga e conecte-se a um computador de suporte correspondente pressionando o controle do PC. No computador de suporte, abra o software rotulado UVProbe 2.61 e conecte-se ao espectrofotômetro clicando em conectar" no canto inferior esquerdo. Clique no espectro e, em seguida, clique em método" na barra de ferramentas superior.
Clique na guia de medição e insira 500 na caixa de texto "start" localizada sob a faixa de comprimento de onda e 300 na caixa de texto "end". Clique no menu suspenso ao lado da guia "velocidade de varredura" e defina-a como média. Prepare uma amostra em branco transferindo um mililitro de DMSO em duas cubetas de quartzo.
Coloque ambas as cubetas nas respectivas portas de amostra do espectrofotômetro. Clique em branco automático" e registre um espectro de 300 a 500 nanômetros clicando em "iniciar" no canto inferior esquerdo. Para a análise espectral padrão da AmpB, remova a cubeta da porta de amostra frontal e adicione 20 microlitros de um miligrama por mililitro de solução estoque de AmpB.
Coloque a cubeta de volta no painel de amostra e clique em "iniciar" para registrar a absorvância da amostra. Depois de registar a absorvância da amostra, remova a cubeta e decante o conteúdo líquido para um recipiente de resíduos. Enxaguar bem a cubeta com três lavagens de água deionizada, seguidas de três lavagens com etanol 70%.
Para a análise espectral do AmpB-Nanodisk interrompido, prepare a amostra pipetando 20 microlitros de um miligrama por mililitro de estoque de AmpB-Nanodisk em um mililitro de DMSO e incube por um minuto antes de registrar o espectro. Carregue a cubeta na porta de amostra frontal e clique em "iniciar" para registrar a absorvância da amostra. Para a análise espectral de um branco tampão PBS, prepare um branco transferindo um mililitro de PBS em duas cubetas de quartzo.
Carregue as cubetas na porta de amostra. Clique em "auto blank" e registre o espectro de 300 a 500 nanômetros. Para a análise espectral de uma amostra de AmpB-Nanodisk não perturbada, remova a cubeta da porta de amostra frontal e adicione 20 microlitros de uma amostra de um miligrama por mililitro de AmpB-Nanodisk no buffer PBS.
Coloque a cubeta de volta no painel de amostras. Clique em "Iniciar" e registre o espectro de amostra. A reação de formulação AmpB-Nanodisk é considerada completa quando a aparência da amostra faz a transição de turva para clara.
Espectroscopia de absorção UV visível de amostras de AmpB em DMSO e PBS é mostrada. Em DMSO, três máximos de absorbância distintos em 372, 392 e 415 nanômetros, picos indicativos de AmpB, foram observados. Os espectros de absorbância dos nanodiscos AmpB em PBS mostraram um único pico de absorbância maior em um comprimento de onda mais curto.
Em comparação, os espectros de absorbância de AmpB-Nanodisks em DMSO pareceram semelhantes aos espectros de estoque de AmpB. A atividade biológica dos nanodiscos AmpB foi realizada avaliando-se ensaios de inibição do crescimento de leveduras. Amostras de controle como PBS, DMSO e lipoproteínas de alta densidade reconstituídas demonstraram que outros componentes de nanodiscos além de AmpB não têm efeito discernível sobre o crescimento de leveduras.
O controle positivo confirmou que a AmpB é um eficiente inibidor do crescimento de leveduras. No caso dos nanodiscos AmpB, foi observada atividade inibitória do crescimento dependente da concentração. Nem todas as preparações de nanodiscos são iguais.
Alguns podem exigir mais tempo, lipídios diferentes, ou diferentes proteínas de andaime. Eles são apenas indistintos} é o esclarecimento da amostra do nanodisco. Esta técnica levou a novas nanopartículas usadas para estudar a cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina, apoptose, interações de ligantes, e entregou numerosas moléculas bioativas insolúveis aquosas, incluindo luteína e curcumina.
