Этот протокол предоставляет практические знания, полезные для создания наноразмерных частиц, т.е. нанодисков, которые стабильно включают широкий спектр гидрофобных биологически активных молекул. Этот метод имеет множество практических применений.
Способность придавать растворимость в воде нерастворимым биологически активным соединениям позволяет использовать нанодиски в приложениях для доставки лекарств. Описанный метод прост. Предпочтительно проводить исследования в описанном масштабе, пять миллиграммов фосфолипида, два миллиграмма каркасного белка, так что образование нанодисков легко контролируется визуальным осмотром.
Продемонстрируют процедуру Майкл Каро и Мэтью Свакхаммер, студенты-исследователи в лаборатории Райана. Чтобы приготовить аликвоту фосфолипида, взвесьте пять миллиграммов DMPC и перенесите его в стеклянную пробирку. Растворите фосфолипид, добавив 300 микролитров хлороформа и 100 микролитров метанола в соотношении три к одному.
Выпарить органический растворитель, поместив стеклянную пробирку под мягкую струю газообразного азота на 10-15 минут, так что вдоль стенок нижней части пробирки образуется тонкая пленка высушенного фосфолипида. Чтобы получить амфотерицин B или AmpB-нанодиски, нанесите пипеткой 450 микролитров PBS на лиофилизированный фосфолипид аликвоту и встряхните в течение 30 секунд, чтобы диспергировать липид. Пипеткой 50 микролитров по 20 миллиграммов на миллилитр наберите раствор AmpB в дисперсный образец фосфолипида и вихрит.
Добавьте 500 микролитров четырех миллиграммов на миллилитр каркасного белка ApoE4 NT в стеклянную пробирку, содержащую дисперсный фосфолипид и AmpB. Ванну обрабатывают ультразвуком при температуре 24 градуса Цельсия до тех пор, пока раствор не осветится. Для диализа AmpB-Nanodisk подготовьте секцию диализной трубки, тщательно замочив ее в дистиллированной деионизированной воде на 10 минут.
Используя зажим для диализной трубки, зажмите один конец пропитанной диализной трубки, чтобы жидкость не могла выйти. Вставьте воронку с узким горлышком в открытый конец диализной трубки и перенесите образец AmpB-Nanodisk в диализную трубку. Снимите воронку и зажмите конец диализной трубки другим зажимом для диализной трубки.
Поместите поплавок для пенного диализа на один из герметичных концов диализной трубки и поместите собранную диализную трубку в стакан, содержащий свежеприготовленный буфер PBS объемом в один литр. Поместите магнитную мешалку в нижнюю часть стакана и установите регулятор перемешивания на низкий уровень, чтобы избежать вихря. Позвольте диализу продолжаться в течение ночи при четырех градусах Цельсия.
Включите спектрофотометр, щелкнув выключателем питания, и подключитесь к соответствующему вспомогательному компьютеру, нажав кнопку управления ПК. На компьютере поддержки откройте программное обеспечение с надписью UVProbe 2.61 и подключитесь к спектрофотометру, нажав «подключиться» в левом нижнем углу. Нажмите на спектр, затем нажмите метод"на верхней панели инструментов.
Нажмите на вкладку измерения и введите 500 в начальное текстовое поле, расположенное в разделе «Диапазон длин волн», и 300 в конец«текстовое поле». Щелкните раскрывающееся меню рядом с вкладкой с надписью «Скорость сканирования»и установите его на средний. Подготовьте заготовку образца, перелив один миллилитр ДМСО в две кварцевые кюветы.
Загрузите обе кюветы в соответствующие отверстия спектрофотометра. Нажмите «Авто пусто» и запишите спектр от 300 до 500 нанометров, нажав «Пуск»в левом нижнем углу. Для стандартного спектрального анализа AmpB извлеките кювету из переднего отверстия для образца и добавьте 20 микролитров одного миллиграмма на миллилитр исходного раствора AmpB.
Загрузите кювету обратно в доску для образцов и нажмите «Пуск», чтобы записать поглощение образца. После регистрации поглощения образца извлеките кювету и сцедите жидкое содержимое в контейнер для отходов. Тщательно промойте кювету тремя промывками деионизированной воды, а затем тремя промывками с 70% этанолом.
Для спектрального анализа разрушенного AmpB-нанодиска подготовьте образец путем пипетирования 20 микролитров одного миллиграмма на миллилитр AmpB-нанодиска в один миллилитр ДМСО и инкубируйте в течение одной минуты перед записью спектра. Загрузите кювету в передний порт для образцов и нажмите «Пуск», чтобы записать поглощение образца. Для спектрального анализа заготовки буфера PBS подготовьте заготовку, перелив один миллилитр PBS в две кварцевые кюветы.
Загрузите кюветы в порт для образцов. Нажмите «Авто пусто» и запишите спектр от 300 до 500 нанометров. Для спектрального анализа образца AmpB-Nanodisk без разрушений извлеките кювету из переднего порта образца и добавьте 20 микролитров образца AmpB-Nanodisk объемом один миллиграмм на миллилитр в буфер PBS.
Загрузите кювету обратно в доску для образцов. Нажмите «Пуск» и запишите спектр выборки. Реакция приготовления AmpB-Nanodisk считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному.
Показана спектроскопия УФ-видимого поглощения образцов AmpB в ДМСО и ПБС. В ДМСО наблюдались три отличительных максимума поглощения на 372, 392 и 415 нанометров, пики, указывающие на AmpB. Спектры поглощения AmpB-нанодисков в PBS показали один крупный пик поглощения на более короткой длине волны.
Для сравнения, спектры поглощения AmpB-нанодисков в ДМСО оказались похожи на спектры стоковых AmpB. Биологическую активность AmpB-нанодисков проводили путем оценки анализа ингибирования роста дрожжей. Контрольные образцы, такие как PBS, DMSO и восстановленные липопротеины высокой плотности, продемонстрировали, что компоненты нанодисков, отличные от AmpB, не оказывают заметного влияния на рост дрожжей.
Положительный контроль подтвердил, что AmpB является эффективным ингибитором роста дрожжей. В случае AmpB-нанодисков наблюдалась концентрация-зависимая активность ингибирования роста. Не все препараты нанодисков одинаковы.
Некоторым может потребоваться больше времени, другие липиды или разные белки каркаса. Они лишь нечеткие} - это осветление образца нанодиска. Этот метод привел к созданию новых наночастиц, используемых для изучения кардиотоксичности, апоптоза, лигандных взаимодействий, вызванных доксорубицином, и доставил многочисленные водные нерастворимые биологически активные молекулы, включая лютеин и куркумин.
