이 프로토콜은 광범위한 소수성 생리 활성 분자를 안정적으로 통합하는 나노 스케일 입자, 즉 나노 디스크를 공식화하는 데 유용한 실용적인 지식을 제공합니다. 이 방법에는 많은 실용적인 응용 프로그램이 있습니다.
불용성 생리활성 화합물에 수용성을 부여하는 능력은 약물 전달 응용 분야에서 나노디스크의 사용을 허용합니다. 설명된 방법은 간단합니다. 나노 디스크의 형성이 육안 검사에 의해 쉽게 모니터링 될 수 있도록, 설명 된 규모, 5 밀리그램 인지질, 2 밀리그램 스캐 폴드 단백질로 연구를 수행하는 것이 바람직하다.
이 절차를 시연하는 것은 Ryan 연구실의 학부생 연구원 인 Michael Karo와 Matthew Swackhammer가 될 것입니다. 인지질 분취액을 제조하기 위해, 5 밀리그램의 DMPC의 무게를 측정하고, 이를 유리 시험관에 옮긴다. 300 마이크로 리터의 클로로포름과 100 마이크로 리터의 메탄올을 3 대 1의 비율로 첨가하여 인지질을 용해시킨다.
유리 시험관을 10 내지 15분 동안 질소 가스의 부드러운 스트림 하에 두어 유기 용매를 증발시키고, 건조된 인지질의 박막이 튜브의 바닥부의 벽을 따라 형성되도록 한다. 암포테리신 B 또는 AmpB 나노디스크를 제형화하기 위해, 동결건조된 인지질 분취액을 450 마이크로리터의 PBS로 피펫하고, 지질을 분산시키기 위해 30초 동안 와동시켰다. 50 마이크로리터의 20 밀리그램 스톡을 AmpB 용액을 분산된 인지질 샘플에 피펫팅하고 와동시킨다.
밀리리터당 4밀리그램의 500마이크로리터 ApoE4 NT 스캐폴드 단백질을 분산된 인지질 및 AmpB를 함유하는 유리 시험관에 첨가한다. 욕조는 용액이 정화 될 때까지 섭씨 24도에서 샘플을 초음파 처리합니다. AmpB-Nanodisk 투석의 경우 투석 튜브를 증류수에 10분 동안 완전히 담가 투석 튜브 섹션을 준비합니다.
투석 튜브 cl 사용amp, clamp 담근 투석 튜브의 한쪽 끝을 액체가 빠져나가지 않도록 합니다. 좁은 목 깔때기를 투석 튜브의 열린 끝에 삽입하고 AmpB-Nanodisk 샘플을 투석 튜브로 옮깁니다. 깔때기를 제거하고 clamp 다른 투석 튜브 cl로 투석 튜브의 끝을 clamp.
투석 튜브의 밀봉된 끝 부분 중 하나에 폼 투석 플로트를 놓고 조립된 투석 튜브를 새로 준비된 1리터 PBS 버퍼가 들어 있는 비커에 넣습니다. 마그네틱 교반 막대를 비커 바닥에 놓고 교반 제어를 낮게 조정하여 소용돌이가 발생하지 않도록 합니다. 섭씨 4도에서 밤새 투석을 계속하십시오.
전원 스위치를 뒤집어 분광 광도계를 켜고 PC 제어를 눌러 해당 지원 컴퓨터에 연결합니다. 지원 컴퓨터에서 UVProbe 2.61이라고 표시된 소프트웨어를 열고 왼쪽 하단 모서리에 있는 연결"을 클릭하여 분광 광도계에 연결합니다. 스펙트럼을 클릭한 다음 상단 도구 모음에서 방법"을 클릭합니다.
측정 탭을 클릭하고 파장 범위 아래에 있는 시작 텍스트 상자에 500을 입력하고 끝 텍스트 상자에 300을 입력합니다. 스캔 속도라고 표시된 탭 옆에 있는 드롭다운 메뉴를 클릭하고 중간으로 설정합니다. 1밀리리터의 DMSO를 두 개의 석영 큐벳에 옮겨 샘플 블랭크를 준비합니다.
두 큐벳을 분광 광도계의 각 샘플 포트에 로드합니다. 자동 공백을 클릭하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 300에서 500나노미터까지의 스펙트럼을 기록합니다. AmpB 표준 스펙트럼 분석의 경우 전면 샘플 포트에서 큐벳을 제거하고 밀리리터당 1밀리그램의 20마이크로리터를 추가합니다.
큐벳을 샘플 보드에 다시 로드하고 시작"을 클릭하여 샘플 흡광도를 기록합니다. 샘플 흡광도를 기록한 후 큐벳을 제거하고 액체 내용물을 폐기물 용기에 디캔팅합니다. 큐벳을 탈 이온수로 3 회 세척 한 후 70 % 에탄올로 3 회 세척합니다.
파괴된 AmpB-나노디스크의 스펙트럼 분석을 위해 1밀리리터당 1밀리그램의 AmpB-나노디스크 스톡 20마이크로리터를 1밀리리터의 DMSO에 피펫팅하여 샘플을 준비하고 스펙트럼을 기록하기 전에 1분 동안 배양합니다. 큐벳을 전면 샘플 포트에 로드하고 시작"을 클릭하여 샘플 흡광도를 기록합니다. PBS 버퍼 블랭크의 스펙트럼 분석을 위해, 1밀리리터의 PBS를 2개의 석영 큐벳에 옮겨 블랭크를 준비한다.
큐벳을 샘플 포트에 로드합니다. 딸깍 하는 소리 자동 공백 "300에서 500 나노 미터까지의 스펙트럼을 기록하십시오. 중단되지 않은 AmpB-Nanodisk 샘플의 스펙트럼 분석을 위해 전면 샘플 포트에서 큐벳을 제거하고 밀리리터당 1밀리그램의 AmpB-Nanodisk 샘플 20마이크로리터를 PBS 버퍼에 추가합니다.
큐벳을 샘플 보드에 다시 로드합니다. 딸깍 하는 소리 시작"샘플 스펙트럼을 기록합니다. AmpB-Nanodisk 제형 반응은 시료 외관이 탁한 상태에서 투명한 상태로 전환될 때 완료된 것으로 간주됩니다.
DMSO 및 PBS에서 AmpB 샘플의 UV 가시광선 흡수 분광법이 도시된다. DMSO에서, 372, 392 및 415 나노미터에서 3개의 독특한 흡광도 최대값(AmpB를 나타내는 피크)이 관찰되었다. PBS에서 AmpB-Nanodisks의 흡광도 스펙트럼은 더 짧은 파장에서 단일 주요 흡광도 피크를 보여주었습니다.
이에 비해 DMSO에서 AmpB-나노디스크의 흡광도 스펙트럼은 스톡 AmpB의 스펙트럼과 유사하게 나타났다. AmpB-Nanodisks의 생물학적 활성은 효모 성장 억제 분석을 평가하여 수행되었습니다. PBS, DMSO 및 재구성 된 고밀도 지단백질과 같은 대조군 샘플은 AmpB 이외의 나노 디스크 성분이 효모 성장에 눈에 띄는 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했습니다.
양성 대조군은 AmpB가 효모 성장의 효율적인 억제제임을 확인했습니다. AmpB-Nanodisks의 경우, 농도 의존적 성장 억제 활성이 관찰되었다. 모든 나노디스크 준비가 동일한 것은 아닙니다.
일부는 더 많은 시간, 다른 지질 또는 다른 스캐폴드 단백질이 필요할 수 있습니다. They only indistinct}는 나노디스크 샘플의 설명입니다. 이 기술은 독소루비신 유도 심장 독성, 세포 사멸, 리간드 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 새로운 나노 입자로 이어졌으며 루테인 및 커큐민을 포함한 수많은 수성 불용성 생리 활성 분자를 전달했습니다.
