وتكمن أهمية هذا النهج في أنه يمكن استخدامه لإعطاء لقاحات متعددة الجرعات في حقنة واحدة، مما قد ينقذ ملايين الأرواح، لا سيما في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل حيث لا يتم تحصين الأطفال حديثي الولادة بسبب تحديات الوصول. تسمح طريقة التصنيع هذه للقاح داء الكلب بالاحتفاظ بمناعته الأصلية التي تمنح الشكل عند تغليفها في جسيمات دقيقة يحاكي إطلاقها جداول التطعيم الحالية بحقنة واحدة فقط. داء الكلب مرض قاتل ، يتطلب ما يصل إلى خمس حقن لقاح متكررة في بعض الحالات لمنع الوفاة.
ومع ذلك ، فإن إعطاء نظام اللقاح الكامل في زيارة واحدة يمكن أن يحسن الالتزام وينقذ الأرواح. تمثل هذه التقنية تقنية منصة قادرة على تقديم علاجات أو وقائية متنوعة لمختلف الأمراض. للبدء ، قم بمعالجة سطح القالب الرئيسي المطبوع 3D عن طريق وضعه في غرفة مفرغة تحتوي على شريحة زجاجية بها 40 ميكرولتر من ثلاثي كلورو سيلان على السطح.
ابدأ الفراغ لمدة ساعة واحدة. امزج قاعدة البوليمر المسبق PDMS وعامل المعالجة بنسبة كتلة 9: 1 في كوب بلاستيكي. بعد ذلك ، انقل المحلول إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي 300 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد الطرد المركزي ، تأكد من أن الحل واضح. بمجرد اكتمال المعالجة السطحية ، ضع القالب الرئيسي في طبق رقائق الألومنيوم واسكب PDMS غير المعالج على القالب ، مما يضمن غمر الميزات بالكامل. ضع طبق رقائق الألومنيوم في غرفة مفرغة واسحب المكنسة الكهربائية لمدة ساعة واحدة لإزالة أي فقاعات هواء.
بعد إزالة طبق رقائق الألومنيوم ، ضع فواصل 800 ميكرومتر في كل طرف من طرفي القالب الرئيسي وقم بتراكب شريحة زجاجية نظيفة على القالب الرئيسي ، وتجنب الفقاعات. استخدم مشابك الموثق لتثبيت القالب فوق الفواصل 800 ميكرون. عالج البوليمر الأولي في الفرن عند 120 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.
بمجرد علاجه ، حرر مقاطع الموثق بعناية. استخدم شفرة حلاقة لفصل القالب الرئيسي عن قالب PDMS المعالج. لتحضير فيلم PLGA ، ضع 450 ملليغرام من PLGA على ورقة بوليمر غير لاصقة داخل رقاقة حلقية.
بعد ذلك ، قم بتراكب لوح بوليمر ثان غير لاصق على PLGA واستخدم مشبك C مقاس 101.6 ملم لضغط المكدس بين كتلتين من الألومنيوم حتى يتم إحكام الإصبع. ضع المجموعة المثبتة على شكل حرف C في فرن مفرغ. بعد 30 دقيقة في الفرن ، شد المشبك وضعه مرة أخرى لمدة 30 دقيقة أخرى.
ثم انقل التجميع إلى مجفف لمدة أربع ساعات ليبرد. بمجرد أن يبرد ، قم بفك المشبك ، وقم بإزالة فيلم PLGA من صفائح البوليمر غير اللاصقة ، وضعه في طبق بتري ملصق. قم بتخزين طبق بتري داخل مجفف لاستخدامه لاحقا.
لتوليد جزيئات PLGA ، تعامل مع سطح قالب PDMS كما هو موضح سابقا. باستخدام ملاقط أو مشرط ، قم بقص فيلم PLGA 250 ميكرون ليكون بحجم مجموعة الجسيمات تقريبا وضعه على قالب PDMS المعالج. قم بتراكب شريحة مجهر زجاجي نظيف على فيلم PLGA فوق قالب PDMS وقم بتثبيتها معا عن طريق وضع مشبك زنبركي فوق المصفوفة وفيلم PLGA.
احتفظ بمجموعة القالب المثبتة في فرن التفريغ لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بتبريدها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بمجرد التبريد ، قم بتطبيق الضغط برفق باستخدام شفرة حلاقة لفصل قالب PDMS عن مجموعة جزيئات PLGA وتخزين جزيئات PLGA في مجفف لمزيد من الاستخدام. لملء الجسيمات بمستضد لقاح داء الكلب المركز ، قم بإعداد موزع كهرضغطية وضع الشريحة التي تحتوي على جزيئات PLGA في منطقة الاستغناء.
قم بتحميل المستضد المركز على اللوحة ، ثم أدخل معلمات الإعداد المستهدفة وانقر فوق تشغيل. ثم يملأ الروبوت الكهرضغطية الجزيئات. بمجرد الانتهاء ، استخدم مجسما للتحقق من امتلاء الجسيمات.
لإغلاق الجسيمات المملوءة ، ضع كتلة من الفولاذ المقاوم للصدأ على صفيحة ساخنة وشريحتين مجهريتين متوازيتين على كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ. بعد تسوية كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بتشغيل لوح التسخين واضبط درجة الحرارة على 205 درجة مئوية. بمجرد الوصول إلى درجة حرارة السطح المطلوبة للفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بتعليق جزيئات PLGA المملوءة على الشريحتين الزجاجيتين وابدأ على الفور مؤقتا لمدة 18 ثانية.
بعد إزالة مجموعة الجسيمات المختومة من لوح التسخين ، قم بتعليقها على شريحتين زجاجيتين على طاولة المختبر وقم بتبريدها لمدة دقيقة واحدة. لحصاد الجسيمات المختومة ، أمسك شفرة المشرط بزاوية 45 درجة على الشريحة واضغط على قاعدة الجسيمات لفصلها عن الشريحة. باستخدام مشرط ، انقل الجسيمات المحصودة إلى أنبوب منخفض الارتباط بالبروتين 0.5 ملليلتر.
أضف 250 ميكرولترا من PBS تحتوي على ألبومين مصل البقر والجلوكوز للحفاظ على استقرار لقاح داء الكلب ضع العينة تحت المجسمة وسحق الجسيمات باستخدام شق واحد على زوج من الملقط ذي الأطراف الدقيقة. أثناء ملء الجسيمات ، يلزم وقت تجفيف كاف لتبخر المذيبات أو الماء الكامل. بعد التجفيف ، يبقى مستودع المذاب في قاع قلب الجسيمات.
لوحظ التشكل المثالي للجسيمات بين أوقات السقف من 18 و 24 ثانية لهذا PLGA ، حيث كانت الجسيمات التي تحتوي على البضائع مغلقة تماما في تلك الأوقات دون أن تفقد بنية الجسيمات. كانت الجسيمات صغيرة بما يكفي لتناسب بسهولة إبرة قياس 19 عند تعبئتها وإغلاقها بشكل صحيح. علاوة على ذلك ، تدفقت 10 جزيئات باستمرار من خلال إبرة قياس 19 عند حقنها في محلول لزج ، مثل 2٪ كربوكسي ميثيل السليلوز.
أشارت الصورة المجهرية الإلكترونية المرسلة إلى متغيرات داء الكلب السليمة في عينة المستضد المركز ، وكانت هذه أكثر تركيزا بحوالي 4.4 أضعاف من محلول مخزون البداية. بعد الختم ، يظل ما يقرب من 69٪ من المستضد مغلفا في شكله النشط بيولوجيا ، مما يشير إلى أن الإجهاد الحراري يسبب خسارة كبيرة أثناء الختم ، لكن معظم المستضد الفيروسي يظل سليما. يعد ملء الجسيمات الدقيقة أحد أهم الخطوات.
إذا لم تمتلئ الجسيمات بشكل صحيح ، فمن غير المرجح أن تغلق الجسيمات بشكل صحيح. لفهم الاستقرار ، سيكون من الضروري تطوير صياغة إضافية ، بما في ذلك السواغات وغيرها من المواد ذات الصلة بيولوجيا في قلب الجسيمات.
