A importância dessa abordagem é que ela poderia ser usada para administrar vacinas de dose múltipla em uma única injeção, potencialmente salvando milhões de vidas, particularmente em países de baixa e média renda, onde os recém-nascidos não são imunizados devido a desafios de acesso. Este método de fabricação permite que a vacina antirrábica mantenha sua forma nativa de imunidade quando encapsulada em micropartículas cuja liberação imita os esquemas de vacinação atuais com apenas uma única injeção. A raiva é uma doença fatal, exigindo até cinco injeções repetidas de vacina em alguns casos para evitar a morte.
No entanto, administrar o esquema vacinal completo em uma visita pode melhorar a adesão e salvar vidas. Essa técnica representa uma tecnologia de plataforma capaz de oferecer diversas terapêuticas ou profilatas para diversas doenças. Para começar, trate a superfície do molde mestre impresso em 3D colocando-a em uma câmara de vácuo contendo uma lâmina de vidro com 40 microlitros de triclorossilano na superfície.
Inicie o vácuo por uma hora. Misture a base de pré-polímero PDMS e o agente de cura a uma proporção de massa de 9:1 em um copo plástico. Em seguida, transfira a solução para um tubo de 50 mililitros e centrifuja 300 G por três minutos à temperatura ambiente.
Após a centrifugação, certifique-se de que a solução está límpida. Quando o tratamento de superfície estiver concluído, coloque o molde mestre em uma placa de folha de alumínio e despeje o PDMS não curado no molde, garantindo que as características fiquem totalmente submersas. Coloque a placa de papel alumínio em uma câmara de vácuo e puxe o vácuo por uma hora para remover quaisquer bolhas de ar.
Depois de remover a placa de folha de alumínio, coloque espaçadores de 800 micrômetros em cada extremidade do molde mestre e sobreponha uma lâmina de vidro limpa sobre o molde mestre, evitando bolhas. Use clipes aglutinantes para prender o molde sobre os espaçadores de 800 mícrons. Cure o pré-polímero no forno a 120 graus Celsius por quatro horas.
Depois de curado, solte cuidadosamente os clipes de aglutinante. Use uma lâmina de barbear para separar o molde mestre do molde PDMS curado. Para preparar o filme de PLGA, coloque 450 miligramas de PLGA em uma folha de polímero antiaderente dentro de um calço de anel.
Em seguida, sobreponha uma segunda folha de polímero antiaderente no PLGA e use uma braçadeira C de 101,6 milímetros para comprimir a pilha entre dois blocos de alumínio até apertar os dedos. Coloque o conjunto C-clampeado em um forno a vácuo. Após 30 minutos no forno, aperte o grampo e coloque-o novamente por mais 30 minutos.
Em seguida, transfira o conjunto para um exsicador por quatro horas para esfriar. Depois de resfriado, solte a braçadeira, retire o filme de PLGA das folhas de polímero antiaderente e coloque-o em uma placa de Petri rotulada. Guarde a placa de Petri dentro de um exsicador para uso posterior.
Para gerar partículas de PLGA, trate a superfície do molde de PDMS como demonstrado anteriormente. Usando uma pinça ou um bisturi, corte o filme de PLGA de 250 mícrons para ter aproximadamente o tamanho da matriz de partículas e coloque-o no molde PDMS tratado. Sobreponha uma lâmina de microscópio de vidro limpa sobre o filme PLGA sobre o molde PDMS e fixe-os juntos colocando uma braçadeira de mola sobre o array e o filme PLGA.
Mantenha o conjunto do molde preso no forno a vácuo por uma hora e, em seguida, resfrie-o à temperatura ambiente por 15 minutos. Uma vez resfriado, aplique suavemente a pressão usando uma lâmina de barbear para separar o molde PDMS do arranjo de partículas PLGA e armazenar as partículas de PLGA em um exsicador para uso posterior. Para preencher as partículas com antígeno concentrado da vacina antirrábica, prepare o dispensador piezoelétrico e coloque a lâmina contendo as partículas de PLGA na área de dispensação.
Carregue o antígeno concentrado na placa, insira os parâmetros de configuração de destino e clique em Executar. O robô piezoelétrico então preencherá as partículas. Depois de concluído, use um estereoscópio para verificar se as partículas foram preenchidas.
Para selar a partícula preenchida, coloque um bloco de aço inoxidável em uma placa quente e duas lâminas paralelas de microscópio no bloco de aço inoxidável. Depois de nivelar o bloco de aço inoxidável, ligue a placa quente e ajuste a temperatura em 205 graus Celsius. Uma vez atingida a temperatura superficial desejada do aço inoxidável, suspenda as partículas de PLGA preenchidas nas duas lâminas de vidro e inicie imediatamente um temporizador por 18 segundos.
Depois de remover a matriz de partículas selada da placa quente, suspenda-a em duas lâminas de vidro na bancada do laboratório e resfrie-a por um minuto. Para colher partículas seladas, segure a lâmina de bisturi em um ângulo de 45 graus em relação à lâmina e aplique pressão na base das partículas para separá-las da lâmina. Usando um bisturi, mova as partículas colhidas para um tubo de 0,5 mililitro de baixa ligação a proteínas.
Adicionar 250 microlitros de PBS contendo albumina de soro bovino e glicose para manter a estabilidade da vacina antirrábica Coloque a amostra sob o estereoscópio e esmague as partículas usando um pino em um par de pinças de ponta fina. Durante o enchimento de partículas, é necessário tempo de secagem suficiente para a evaporação completa do solvente ou da água. Após a secagem, um depósito de solutos permanece no fundo do núcleo de partículas.
A morfologia ideal das partículas foi observada entre os tempos de teto de 18 e 24 segundos para este PLGA, uma vez que as partículas contendo carga foram completamente seladas nesses tempos sem perder a estrutura das partículas. As partículas eram pequenas o suficiente para caber facilmente em uma agulha de calibre 19 quando devidamente embaladas e seladas. Além disso, 10 partículas fluíram consistentemente através de uma agulha de calibre 19 ao injetá-las em uma solução viscosa, como a carboximetilcelulose a 2%.
A micrografia eletrônica de transmissão indicou variantes intactas da raiva na amostra concentrada de antígeno, e estas foram aproximadamente 4,4 vezes mais concentradas do que a solução estoque inicial. Após o selamento, aproximadamente 69% do antígeno permanece encapsulado em sua forma bioativa, sugerindo que o estresse térmico causa perda significativa durante o selamento, mas a maior parte do antígeno viral permanece intacta. O enchimento de micropartículas é uma das etapas mais críticas.
Se as partículas não forem preenchidas corretamente, é improvável que as partículas selem corretamente. Para entender a estabilidade, seria necessário o desenvolvimento de formulações adicionais, incluindo excipientes e outros materiais biologicamente relevantes no núcleo de partículas.
