Die Bedeutung dieses Ansatzes besteht darin, dass er zur Verabreichung von Impfstoffen mit mehreren Dosen in einer einzigen Injektion verwendet werden könnte, was potenziell Millionen von Leben retten könnte, insbesondere in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, in denen Neugeborene aufgrund von Zugangsproblemen nicht geimpft werden. Diese Herstellungsmethode ermöglicht es dem Tollwutimpfstoff, seine natürliche immunitätsverleihende Form beizubehalten, wenn er in Mikropartikeln eingekapselt ist, deren Freisetzung die aktuellen Impfpläne mit nur einer einzigen Injektion nachahmt. Tollwut ist eine tödliche Krankheit, die in einigen Fällen bis zu fünf wiederholte Impfinjektionen erfordert, um den Tod zu verhindern.
Die Verabreichung des gesamten Impfschemas in einem Besuch kann jedoch die Adhärenz verbessern und Leben retten. Diese Technik stellt eine Plattformtechnologie dar, die in der Lage ist, verschiedene Therapeutika oder Prophylaxemittel für verschiedene Krankheiten bereitzustellen. Behandeln Sie zunächst die Oberfläche der 3D-gedruckten Urform, indem Sie sie in eine Vakuumkammer legen, die einen Objektträger mit 40 Mikrolitern Trichlorsilan auf der Oberfläche enthält.
Starten Sie den Staubsauger für eine Stunde. Mischen Sie die PDMS-Prepolymerbasis und den Härter in einem Massenverhältnis von 9:1 in einen Kunststoffbecher. Dann die Lösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen und 300 G drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Stellen Sie nach dem Zentrifugieren sicher, dass die Lösung klar ist. Sobald die Oberflächenbehandlung abgeschlossen ist, legen Sie die Stammform in eine Aluminiumfolienschale und gießen Sie das nicht ausgehärtete PDMS auf die Form, um sicherzustellen, dass die Merkmale vollständig untergetaucht sind. Stellen Sie die Aluminiumfolienschale in eine Vakuumkammer und ziehen Sie das Vakuum eine Stunde lang, um alle Luftblasen zu entfernen.
Nachdem Sie die Aluminiumfolienschale entfernt haben, platzieren Sie 800-Mikrometer-Abstandshalter an jedem Ende der Urform und legen Sie einen sauberen Glasschieber auf die Urform, um Blasen zu vermeiden. Verwenden Sie Bindeklammern, um die Form über die 800-Mikron-Abstandshalter zu klemmen. Das Prepolymer vier Stunden lang im Ofen bei 120 Grad Celsius aushärten.
Sobald es ausgehärtet ist, lösen Sie vorsichtig die Bindeklammern. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Urform von der ausgehärteten PDMS-Form zu trennen. Zur Vorbereitung der PLGA-Folie legen Sie 450 Milligramm PLGA auf eine antihaftbeschichtete Polymerfolie innerhalb einer Ringunterlegscheibe.
Legen Sie dann eine zweite Antihaft-Polymerfolie auf den PLGA und verwenden Sie eine 101,6-Millimeter-C-Klemme, um den Stapel zwischen zwei Aluminiumblöcken fingerfest zu komprimieren. Legen Sie die C-geklemmte Baugruppe in einen Vakuumofen. Ziehen Sie nach 30 Minuten im Ofen die Klemme fest und setzen Sie sie für weitere 30 Minuten wieder ein.
Übertragen Sie die Baugruppe dann zum Abkühlen für vier Stunden in einen Exsikkator. Lösen Sie nach dem Abkühlen die Klemme, entfernen Sie die PLGA-Folie von den antihaftbeschichteten Polymerfolien und legen Sie sie in eine beschriftete Petrischale. Bewahren Sie die Petrischale zur späteren Verwendung in einem Exsikkator auf.
Um PLGA-Partikel zu erzeugen, behandeln Sie die PDMS-Formoberfläche wie zuvor gezeigt. Schneiden Sie die 250-Mikron-PLGA-Folie mit einer Pinzette oder einem Skalpell so zu, dass sie ungefähr die Größe des Partikelarrays hat, und legen Sie sie auf die behandelte PDMS-Form. Legen Sie einen sauberen Glasobjektträger auf die PLGA-Folie auf der PDMS-Form und befestigen Sie sie miteinander, indem Sie eine Federklemme über das Array und die PLGA-Folie legen.
Bewahren Sie die eingespannte Formbaugruppe eine Stunde lang im Vakuumofen auf und kühlen Sie sie dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ab. Üben Sie nach dem Abkühlen vorsichtig den Druck mit einer Rasierklinge aus, um die PDMS-Form vom PLGA-Partikelarray zu trennen, und lagern Sie die PLGA-Partikel zur weiteren Verwendung in einem Exsikkator. Um die Partikel mit konzentriertem Tollwutimpfantigen zu füllen, bereiten Sie den piezoelektrischen Dispenser vor und legen Sie den Objektträger mit den PLGA-Partikeln in den Dosierbereich.
Laden Sie das konzentrierte Antigen auf die Platte, geben Sie dann die Ziel-Setup-Parameter ein und klicken Sie auf Ausführen. Der piezoelektrische Roboter füllt dann die Partikel. Verwenden Sie anschließend ein Stereoskop, um zu überprüfen, ob die Partikel gefüllt wurden.
Um das gefüllte Partikel zu versiegeln, legen Sie einen Edelstahlblock auf eine Heizplatte und zwei parallele Objektträger auf den Edelstahlblock. Nachdem Sie den Edelstahlblock nivelliert haben, schalten Sie die Heizplatte ein und stellen Sie die Temperatur auf 205 Grad Celsius ein. Sobald die gewünschte Oberflächentemperatur des Edelstahls erreicht ist, hängen Sie die gefüllten PLGA-Partikel an den beiden Objektträgern auf und starten Sie sofort einen Timer für 18 Sekunden.
Nachdem Sie das versiegelte Partikelarray von der Heizplatte entfernt haben, hängen Sie es auf zwei Glasobjektträgern auf dem Labortisch auf und kühlen Sie es eine Minute lang ab. Um versiegelte Partikel zu ernten, halten Sie die Skalpellklinge in einem 45-Grad-Winkel zum Objektträger und üben Sie Druck auf die Basis der Partikel aus, um sie vom Objektträger zu trennen. Bewegen Sie die geernteten Partikel mit einem Skalpell in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Proteinbindung.
Fügen Sie 250 Mikroliter PBS hinzu, das Rinderserumalbumin und Glukose enthält, um die Stabilität des Tollwutimpfstoffs aufrechtzuerhalten Legen Sie die Probe unter das Stereoskop und zerkleinern Sie die Partikel mit einem Zinken auf einer Pinzette mit feiner Spitze. Bei der Partikelabfüllung ist eine ausreichende Trocknungszeit für eine vollständige Lösemittel- oder Wasserverdunstung erforderlich. Nach dem Trocknen verbleibt ein gelöstes Stoffdepot am Boden des Partikelkerns.
Die ideale Morphologie der Partikel wurde für dieses PLGA zwischen Deckenzeiten von 18 und 24 Sekunden beobachtet, da Partikel, die Fracht enthielten, zu diesen Zeiten vollständig versiegelt waren, ohne die Partikelstruktur zu verlieren. Die Partikel waren klein genug, um bei richtiger Verpackung und Versiegelung problemlos in eine 19-Gauge-Nadel zu passen. Darüber hinaus flossen 10 Partikel gleichmäßig durch eine 19-Gauge-Nadel, wenn sie in eine viskose Lösung, wie z. B. 2%Carboxymethylcellulose, injiziert wurden.
Die transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme zeigte intakte Tollwutvarianten in der konzentrierten Antigenprobe, und diese waren etwa 4,4-fach konzentrierter als die Ausgangslösung. Nach der Versiegelung bleiben etwa 69 % des Antigens in seiner bioaktiven Form verkapselt, was darauf hindeutet, dass Hitzestress während der Versiegelung zu erheblichen Verlusten führt, aber der größte Teil des viralen Antigens bleibt intakt. Die Abfüllung von Mikropartikeln ist einer der kritischsten Schritte.
Wenn die Partikel nicht richtig gefüllt sind, ist es unwahrscheinlich, dass die Partikel richtig versiegelt werden. Um die Stabilität zu verstehen, wäre eine zusätzliche Formulierungsentwicklung erforderlich, einschließlich Hilfsstoffen und anderer biologisch relevanter Materialien im Partikelkern.
