Значение этого подхода заключается в том, что его можно использовать для введения нескольких доз вакцин за одну инъекцию, что потенциально может спасти миллионы жизней, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода, где новорожденные не иммунизируются из-за проблем с доступом. Этот метод изготовления позволяет вакцине против бешенства сохранять свою нативную форму, придающую иммунитет, при инкапсуляции в микрочастицы, высвобождение которых имитирует текущие графики вакцинации только с одной инъекцией. Бешенство является смертельным заболеванием, требующим до пяти повторных инъекций вакцины в некоторых случаях для предотвращения смерти.
Тем не менее, введение полной схемы вакцинации за одно посещение может улучшить приверженность и спасти жизни. Этот метод представляет собой платформенную технологию, способную предоставлять разнообразные терапевтические или профилактические средства для различных заболеваний. Для начала обработайте поверхность мастер-формы, напечатанную на 3D-принтере, поместив ее в вакуумную камеру, содержащую предметное стекло с 40 микролитрами трихлорсилана на поверхности.
Запустите пылесос на один час. Смешайте основу преполимера PDMS и отвердитель в массовом соотношении 9:1 в пластиковом стаканчике. Затем перелейте раствор в 50-миллилитровую пробирку и центрифугу 300 г в течение трех минут при комнатной температуре.
После центрифугирования убедитесь, что раствор прозрачный. После завершения обработки поверхности поместите мастер-форму в чашку из алюминиевой фольги и вылейте неотвержденный PDMS на форму, убедившись, что элементы полностью погружены в воду. Поместите чашку из алюминиевой фольги в вакуумную камеру и потяните пылесос на один час, чтобы удалить пузырьки воздуха.
После снятия тарелки из алюминиевой фольги поместите 800-микрометровые прокладки на каждый конец мастер-формы и наложите чистое стеклянное предметное стекло на мастер-форму, избегая пузырьков. Используйте зажимы для связующего, чтобы зажать форму над 800-микронными прокладками. Отверждайте форполимер в духовке при температуре 120 градусов Цельсия в течение четырех часов.
Как только он затвердеет, осторожно отпустите зажимы связующего. Используйте лезвие бритвы, чтобы отделить мастер-форму от отвержденной формы PDMS. Для приготовления пленки PLGA поместите 450 миллиграммов PLGA на антипригарный полимерный лист в кольцевую прокладку.
Затем наложите второй антипригарный полимерный лист на PLGA и используйте 101,6-миллиметровый C-образный зажим, чтобы сжать стек между двумя алюминиевыми блоками до плотного прилегания пальцев. Поместите узел с С-образным зажимом в вакуумную духовку. Через 30 минут в духовке затяните зажим и поместите его обратно еще на 30 минут.
Затем переложите сборку в эксикатор на четыре часа, чтобы она остыла. После охлаждения ослабьте зажим, снимите пленку PLGA с антипригарных полимерных листов и поместите ее в чашку Петри с маркировкой. Храните чашку Петри в эксикаторе для последующего использования.
Для генерации частиц PLGA обработайте поверхность пресс-формы PDMS, как показано ранее. С помощью пинцета или скальпеля разрежьте пленку PLGA размером 250 микрон примерно до размера массива частиц и поместите ее на обработанную форму PDMS. Наложите предметное стекло микроскопа на пленку PLGA поверх формы PDMS и закрепите их вместе, поместив пружинный зажим на матрицу и пленку PLGA.
Держите зажатую форму в вакуумной печи в течение одного часа, затем охладите ее при комнатной температуре в течение 15 минут. После охлаждения осторожно приложите давление с помощью бритвенного лезвия, чтобы отделить форму PDMS от массива частиц PLGA, и сохраните частицы PLGA в эксикаторе для дальнейшего использования. Чтобы заполнить частицы концентрированным антигеном вакцины против бешенства, подготовьте пьезоэлектрический дозатор и поместите предметное стекло, содержащее частицы PLGA, в зону дозирования.
Загрузите концентрированный антиген на пластину, затем введите параметры настройки цели и нажмите «Выполнить». Затем пьезоэлектрический робот заполнит частицы. После завершения используйте стереоскоп, чтобы убедиться, что частицы заполнены.
Для герметизации заполненной частицы поместите блок из нержавеющей стали на горячую пластину и два параллельных предметных стекла микроскопа на блок из нержавеющей стали. После выравнивания блока из нержавеющей стали включите конфорку и установите температуру 205 градусов по Цельсию. Как только желаемая температура поверхности нержавеющей стали будет достигнута, подвесьте заполненные частицы PLGA на двух предметных стеклах и немедленно запустите таймер на 18 секунд.
После извлечения герметичного массива частиц из конфорки подвесьте его на двух предметных стеклах на лабораторном столе и охладите в течение одной минуты. Чтобы собрать запечатанные частицы, держите лезвие скальпеля под углом 45 градусов к предметному стеклу и надавите на основание частиц, чтобы отделить их от предметного стекла. С помощью скальпеля переместите собранные частицы в 0,5-миллилитровую пробирку с низким уровнем связывания белка.
Добавьте 250 микролитров PBS, содержащего бычий сывороточный альбумин и глюкозу, для поддержания стабильности вакцины против бешенства Поместите образец под стереоскоп и раздавите частицы одним зубцом пинцета с тонким наконечником. Во время наполнения частицами требуется достаточное время высыхания для полного испарения растворителя или воды. После высыхания на дне ядра частиц остается депо растворенного вещества.
Идеальная морфология частиц наблюдалась между потолочными временами от 18 до 24 секунд для этого PLGA, поскольку частицы, содержащие груз, были полностью запечатаны в это время без потери структуры частиц. Частицы были достаточно маленькими, чтобы легко поместиться в иглу 19-го калибра при правильной упаковке и запечатывании. Кроме того, 10 частиц последовательно проходили через иглу 19-го калибра при введении их в вязкий раствор, такой как 2% карбоксиметилцеллюлоза.
Просвечивающая электронная микрофотография показала интактные варианты бешенства в концентрированном образце антигена, и они были примерно в 4,4 раза более концентрированными, чем исходный исходный раствор. После герметизации примерно 69% антигена остается инкапсулированным в его биологически активной форме, что позволяет предположить, что тепловой стресс вызывает значительную потерю во время герметизации, но большая часть вирусного антигена остается нетронутой. Заполнение микрочастицами является одним из наиболее важных этапов.
Если частицы заполнены неправильно, маловероятно, что частицы будут правильно запечатываться. Для понимания стабильности потребуется дополнительная разработка рецептуры, включая вспомогательные вещества и другие биологически значимые материалы в ядре частицы.
