يشكر المؤلفون روبرت شوستر على المساعدة في التحقق من البيانات.

يظهر سير العمل عالي المستوى ل mAbScale في الشكل 2. تحتوي كل خطوة على فروع قرار داخلية وحلقات وتوافقيات أكثر تطورا. يتم تقديم سير عمل خوارزمي مفصل يصف عملية الحساب في الشكل التكميلي 1. يتم حفظ إخراج التطبيق بتنسيق جدول بيانات في المجلد المحدد من قبل المستخدم. يتكون ملف الإخراج من أوراق عمل منفصلة متعددة ، والتي يمكن تصنيفها على أنها مدخلات المستخدم ، وحسابات الوزن الجزيئي ، ومراجع لمتوسط اشتقاقات الكتلة النظيرية (يتم توفير مثال المخرجات في الجداول التكميلية). تتضمن أوراق عمل إدخال المستخدم تسلسلات الأحماض الأمينية البروتينية والمعلومات الأخرى التي أدخلها المستخدم ، ومتوسط الكتل الأولية ، وكتل الجليكان ، والتي تستخدم لحساب التركيب الأولي والأوزان الجزيئية المختلفة. تشمل أوراق حساب الوزن الجزيئي التركيب الكيميائي لأشكال مختلفة ، والكتلة المخفضة مع وبدون الجليكوزيل والتعديل الكيميائي ، والكتلة السليمة مع وبدون الجليكوزيل والتعديل الكيميائي. سيتم إنشاء الأوراق التي تحتوي على كتل نصف الأجسام المضادة تلقائيا إذا قام المستخدم بإدخال اثنين من HCs مختلفين و / أو اثنين من LCs مختلفة في صفحة إدخال المستخدم ، نظرا لأن الأجسام المضادة النصفية هي شوائب أولية يجب تحديدها وقياسها كميا بالنسبة إلى heterodimer المطلوب. يمكن الوصول إلى الكود المصدري ل mAbScale من خلال المستودع التالي: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg"> الشكل 2: نظرة عامة على الخطوات المتبعة في حساب التراكيب والكتل الأولية باستخدام التطبيق. يمكن استخدام الترميز اللوني للربط بتدفق العملية الموصوف في الشكل التكميلي 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
1. فتح تطبيق mAbscale
<ol><li>افتح تطبيق البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة الملف القابل للتنفيذ.</li>
</ol>2. إدخال التسلسل
<ol><li>أدخل تسلسلات السلسلة الثقيلة والسلسلة الخفيفة في مربعات النص المعنية المميزة ب 1 بدون أي مسافات.<ol><li>بالنسبة إلى bsAbs، أضف سلاسل ثقيلة أو خفيفة إضافية في المجموعة الثانية من مربعات النص التي تحمل علامة 2. اترك 2 فارغا ل mAbs ذات السلاسل الثقيلة والسلاسل الخفيفة المتطابقة.</li>
		<li>حدد خانات الاختيار N-Terminal Cyclization و/أو C-Terminal Clipping ، إذا كانت هذه المتغيرات الطرفية ذات السلسلة الثقيلة قابلة للتطبيق.</li>
		<li>أضف أي تعديلات كيميائية ، بما في ذلك الرابط والحمولة لجزيئات ADC ، إلى مربعات نص Heavy Chain Chem Mod و / أو Light Chain Chem Mod .<ol><li>حدد التعديلات على هيئة تركيبات عنصرية، مثل CaCl2. ستتم إضافة التعديل إلى الوحدة الفرعية أو السلسلة البروتينية المعنية. ملاحظة: يمكن أيضا طرح التركيب الكيميائي من وحدة فرعية أو سلسلة عن طريق بادئة التركيب الأولي بعلامة -. على سبيل المثال ، سوف يطرح -H2O جزيء ماء من تكوين الوحدة الفرعية والكتلة.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. تحديد عدد روابط ثاني كبريتيد
<ol><li>حدد عدد روابط ثاني كبريتيد في جزيئات البروتين في مربع النص الذي يحمل علامة إجمالي عدد ثاني كبريتيدات.</li>
	<li>أدخل عدد ثاني كبريتيد HC غير المختزل في مربع النص ثاني كبريتيد HC غير المختزل وعدد ثاني كبريتيد LC غير المختزل في مربع النص ثاني كبريتيد LC غير المختزل، بناء على مدى الاختزال (الكامل مقابل الجزئي). ملاحظة: يتضمن تحليل الكتلة المخفضة للوحدات الفرعية mAb تقليل / فصل السلاسل الثقيلة والخفيفة المرتبطة بثاني كبريتيد.</li>
	<li>إذا كان الجليكوزيل موجودا على سلسلة ضوء mAb ، فحدد خانة الاختيار السلسلة الخفيفة هي جليكوزيلاتيد .</li>
</ol>4. إعداد مجلد الإخراج وتشغيل التطبيق
<ol><li>انقر فوق الزر "استعراض" لتحديد مجلد إخراج لمربع نص مجلد الإخراج .</li>
	<li>أدخل اسم ملف الإخراج بدون امتداد ملف (يتم حفظه تلقائيا ك .xlsx) في مربع نص ملف Excel (بدون تحويلة ).</li>
	<li>انقر فوق الزر إرسال لبدء التطبيق. يمكن العثور على ملف الإخراج في المجلد المعين. ملاحظة: يمكن تخصيص الكتل الأولية وقائمة الجليكان عن طريق تحرير الملفات النصية المحددة Element_Mass.csv (ملف الترميز التكميلي 1) و Glycan.csv (ملف الترميز التكميلي 2) ، على التوالي. يجب وضع هذه الملفات في نفس المجلد مثل mAbScale.exe (ملف الترميز التكميلي 3) الملف القابل للتنفيذ التطبيق. سيتم إغلاق التطبيق تلقائيا بعد تنفيذ واحد. سيتعين على المستخدم بدء تشغيل التطبيق مرة أخرى إذا كانت هناك حاجة إلى حساب ثان.</li>
</ol>

أداة قائمة على Python لحساب الكتلة الدقيقة للكيانات العلاجية الحيوية

<ol>
	<li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics.">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li><li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment.">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li><li>Wang, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+biology,+and+structure-based+therapeutics+development.">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018)</li><li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry.">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li><li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies.">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li><li>Beck, A., Sanglier-Cianf&#233;rani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosimilar,+biobetter,+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry.">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li><li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+LC-MS:+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up,+middle-up+and+intact+approaches.">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li><li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules.">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li><li>Jakes, C., F&#252;ssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry.">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li><li>Robotham, A. C., Kelly, J. F., Matte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+-+LC-MS+characterization+of+antibody-based+therapeutics:+Recent+highlights+and+future+prospects.">Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects.</a> Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. , 1-33 (2020).</li><li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li><li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry.">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li><li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+(IUPAC+Technical+Report).">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ame2012+atomic+mass+evaluation.">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li><li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides.">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li><li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry.">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li><li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies:+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods.">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li><li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure,+function+and+therapeutic+potential.">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li><li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine.">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li><li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+site+localization+scoring:+Strategies+and+performance.">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li></ol>

يتم إصدار هذا البرنامج بموجب ترخيص Apache 2.0. حقوق الطبع والنشر (2022) لشركة جلاكسو سميث كلاين للأبحاث والتطوير المحدودة. كل الحقوق محفوظة. مرخص بموجب ترخيص Apache ، الإصدار 2.0 ("الترخيص") ؛ لا يجوز لك استخدام هذا الملف إلا وفقا للترخيص. يمكنك الحصول على نسخة من الترخيص في http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. ما لم يكن ذلك مطلوبا بموجب القانون المعمول به أو متفقا عليه كتابيا ، يتم توزيع البرامج الموزعة بموجب الترخيص على أساس "كما هي" ، دون ضمانات أو شروط من أي نوع ، سواء كانت صريحة أو ضمنية. راجع الترخيص لمعرفة اللغة المحددة التي تحكم الأذونات والقيود بموجب الترخيص. L.C. هو موظف في شركة جلاكسو سميث كلاين (GSK). طور T.H. و K.K. هذا البرنامج كموظفين في GSK وهما الآن شركاء في Merck و Moderna ، على التوالي.

يوفر mAbScale واجهة مستخدم سهلة الاستخدام مع المرونة لتغيير اللبنات الأساسية لحسابات الكتلة والعناصر. من المتوقع أن يكون لدى المستخدمين فهم أساسي للجزيء المستهدف لاستخدام التطبيق ، واشتقاق الكتل الصحيحة ، وتفسير النتائج. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون ورقة إخراج الكتلة السليمة أو المخفضة سا...

على مدى العقدين الماضيين ، تطورت العلاجات الحيوية لتصبح الدعامة الأساسية لصناعة الأدوية الحديثة. أدى جائحة SARS-CoV2 والظروف الأخرى التي تهدد الحياة إلى زيادة الحاجة إلى تطوير أسرع وأوسع لجزيئات المستحضرات الصيدلانية الحيوية1،2،3.
الوزن الجزيئي للعلاج الحيوي أمر بالغ الأهمية لتحديد الجزيء ، بالاقتران مع المقايسات التحليلية الأخرى. يتم استخدام كتل الوحدات الفرعية السليمة والمخفضة طوال دورات حياة الاكتشاف والتطوير كجزء من استراتيجيات التحكم التي تهدف إلى الحفاظ على الجودة ، كما هو موضح في QTPP (ملف تعريف المنتج المستهدف للجودة)4.
يعتمد التطور التحليلي في صناعة المستحضرات الصيدلانية البيولوجية بشكل كبير على قياسات الكتلة لتحليل الكتلة السليمة والتوصيف العميق باستخدام رسم خرائط الببتيد أو مراقبة طريقة متعددة السمات (MAM). في قلب هذه التقنيات التي تستخدم منصات قياس الطيف الكتلي الحديثة (MS) هي القدرة على توفير قياسات كتلة دقيقة عالية الدقة (HR / AM). تنتج معظم أدوات HR / AM دقة جماعية في نطاق 0.5-5 جزء في المليون ، والتي تتناسب مع نطاق الكتلة. تتيح القدرة على قياس الكتل بدقة للجزيئات الكبيرة السليمة التعرف السريع والواثق على علاجات الجزيئات الكبيرة. وبما أنه لا يمكن تحقيق الاستبانة النظيرية باستخدام الظروف التجريبية النموذجية للجزيئات الكبيرة (>10 كيلو دالتون)، يجب حساب متوسط الكتل للمقارنة وتحديد 5,6.
يمثل طيف كتلة البروتين النموذجي السليم أو الفرعي ملف تعريف البروتيوفورم العام ، والذي يحتوي على معلومات مركبة عن الأشكال الجزيئية المختلفة الناتجة عن تعديلات ما بعد الترجمة (PTM) وأي اختلافات في البنية الأولية ، مثل المقاطع أو متغيرات التسلسل. إن الطبيعة السهلة نسبيا وعالية الإنتاجية لهذه القياسات تجعلها جذابة للتوصيف وكضوابط مراقبة أثناء العملية 7,8. عادة ما يتطلب تحليل البيانات لهذه التجارب من المستخدم تحديد مساحة البحث للأشكال الجزيئية (نطاق PTMs أو الأشكال الجزيئية الأخرى). بالنسبة للبروتينات الغليكوزيلاتية ، فإن مساحة البحث هذه مدفوعة إلى حد كبير بعدم تجانس الجليكوفورم. إن مجموعات من PTMs المتعددة ، وتكوينات رابطة ثاني كبريتيد ، والاختلافات الأخرى على طول الهيكل الأساسي تجعل حساب جميع الأشكال الجزيئية الممكنة مهمة شاقة. لذلك ، فإن الحساب اليدوي للأشكال الجزيئية المحتملة هو عملية مستهلكة للوقت والموارد مع احتمال كبير للخطأ البشري.
هنا ، نقدم أداة حساب الكتلة التي تم تطويرها مع الأخذ في الاعتبار أهم ميزات جزيئات العلاج الحيوي ، مثل mAbs و bsAbs و ADCs وما إلى ذلك. تتيح الأداة سهولة دمج متغيرات مساحة البحث من أجل الحساب المتسق للكتل والتراكيب الأولية. وستمكن الطبيعة المعيارية لهذه الأداة من مواصلة تطويرها وتطبيقها على حساب الكتلة ومطابقة الكتلة بالنسبة للطرائق الأخرى.
تسمح وحدة واجهة المستخدم الرسومية للمستخدم بتحديد مدخلات حساب الكتلة ، كما هو موضح في الشكل 1 ؛ على وجه التحديد ، يقوم المستخدم بإدخال تسلسلات الأحماض الأمينية المكونة من حرف واحد لسلاسل الأجسام المضادة الخفيفة والثقيلة. يتم تضمين التعديلات الشائعة لتدوير N-terminal الثقيل وقص اللايسين C-terminal كخانات اختيار. علاوة على ذلك ، يمكن إضافة / طرح الصيغة الكيميائية / التركيب الأولي من سلاسل البروتين هذه من خلال مربع نص Chem Mod المعني. يتيح ذلك للمستخدم المرونة في إضافة تركيبة عنصرية تتضمن تعديلات متعددة بعد الترجمة أو حمولة جزيء صغير في حالة ADC. نظرا لأن معظم mAbs العلاجية مصممة لإزالة مواقع الجليكوزيل في سلسلة الضوء ، يتم ترك الجليكوزيل في سلسلة الضوء اختياريا ويمكن تحديده باستخدام خانة اختيار في واجهة المستخدم الرسومية.
الاختلاف النموذجي في تحليل الكتلة السليمة للأجسام المضادة هو تحليل كتلة الوحدة الفرعية المختزلة ، حيث يتم فصل السلسلة الخفيفة عن السلسلة الثقيلة عن طريق تقليل روابط ثاني كبريتيد السلاسل البينية. اعتمادا على قوة عامل الاختزال المستخدم ، قد تكون أو لا تكون روابط ثاني كبريتيد داخل السلسلة مشقوقة. يتمتع المستخدمون بالمرونة في إدخال العدد الإجمالي لروابط ثاني كبريتيد اعتمادا على النوع الفرعي IgG أو في حالةADC 9 المترافق بالسيستين.
يحسب التطبيق الكتل بطريقة من أسفل إلى أعلى ، حيث يتم حساب التراكيب الأولية أولا للسلاسل الثقيلة الفردية والسلاسل الخفيفة. بعد ذلك ، يتم حساب Lys-Clipping ذات السلسلة الثقيلة (HC) N-terminal cyclization عن طريق ضبط التراكيب الأولية المحسوبة. ثم يتم تطبيق أي تعديلات كيميائية محددة على السلاسل الثقيلة و / أو الخفيفة. اعتمادا على نوع التحليل وأنماط رابطة ثاني كبريتيد المحددة من قبل المستخدم ، يتم ضبط عدد الهيدروجين لسلسلتي عديد الببتيد. يتم حساب كتل HC الغليكوزيلاتي والسلسلة الخفيفة (LC) (اختيارية) بناء على مدخلات المستخدم. أخيرا ، يتم دمج كتل HC و LC متعددة ، ويتم تحديث أرقام روابط ثاني كبريتيد تلقائيا لحساب الكتلة السليمة.
مع الجزيئات الأكبر مثل البروتينات السليمة ، لا يمكن قياس الكتل أحادية النظائر بسبب عيب الكتلة المضافة عند استخدام مطياف الكتلة مع قوة حل نموذجية. بدلا من ذلك ، يتم قياس الكتل الاسمية أو المتوسطة أو الإبلاغ عنها5،10،11،12،13. يمكن أن يختلف متوسط الكتل الأولية بناء على المصدر المستخدم للكتل المنسقة14,15. في حين أن الاختلافات في الكتل الأولية قد تكون صغيرة ، إلا أنها يمكن أن تضيف ما يصل إلى قيم مهمة لحسابات الوزن الجزيئي للجزيء الكبير. يوضح الجدول التكميلي 1 متوسط الكتل الأولية المستخدمة افتراضيا في تطبيق البرنامج. بالنسبة للبيئات الخاضعة للتنظيم مثل مجال البحث والتطوير في مجال المستحضرات الصيدلانية الحيوية (R&D) ، من المهم الحفاظ على كتل جزيئية متسقة لأن التغييرات في الكتل قد تعني تغييرات في الكيان الجزيئي أثناء الإيداعات التنظيمية. لتمكين الاتساق في استخدام الكتل الأولية ، يتم تضمين قاموس للكتل الأولية مع أداة البرنامج كملف نصي لقيمة مفصولة بفواصل (csv): Element_Mass.csv (ملف الترميز التكميلي 1). وبالمثل ، يتم تضمين قائمة منسقة من تركيبات الجليكان التي تظهر عادة على mAbs: Glycan .csv (ملف الترميز التكميلي 2). يتم حفظ كلا الملفين في نفس موقع المجلد كتطبيق قابل للتنفيذ ويمكن للمستخدم تعديلهما لاستخدام قائمة كتلة عنصرية محددة أو مكتبة جليكان.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg"> الشكل 1: واجهة المستخدم الرسومية لتطبيق mAbScale. تسمح وحدة واجهة المستخدم الرسومية للمستخدم بتحديد الإدخال لحساب الكتلة. يقوم المستخدم بإدخال تسلسلات الأحماض الأمينية المكونة من حرف واحد لسلاسل الأجسام المضادة الخفيفة والثقيلة. يتم تضمين التعديلات الشائعة لتدوير N-terminal الثقيل وقص ليسين C-terminal كخانات اختيار. يمكن إضافة / طرح الصيغ الكيميائية / التركيبات الأولية من خلال مربع نص Chem Mod المعني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Modular system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody-drug conjugate (ADC)</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Proprietory molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEH 200 SEC column&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>176003904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bispecific mAb</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Proprietory molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Byos</td>
			<td>Protein Metrics, Cupertino, CA</td>
			<td>https://proteinmetrics.com/byos/ 
			Version 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW</td>
			<td>GPMAW</td>
			<td>http://www.gpmaw.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb standard&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>186009125</td>
			<td>Waters Humanized mAb Mass Check Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAbScale</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>Apache License, Version 2.0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Modular system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open-source framework for mass calculation of antibody-based therapeutic molecules

كتل العلاج الحيوي هي وسيلة للتحقق من الهوية والسلامة الهيكلية. يوفر قياس الطيف الكتلي (MS) للبروتينات السليمة أو الوحدات الفرعية للبروتين أداة تحليلية سهلة لمراحل مختلفة من تطوير المستحضرات الصيدلانية الحيوية. يتم تأكيد هوية البروتين عندما تكون الكتلة التجريبية من MS ضمن نطاق خطأ الكتلة المحدد مسبقا للكتلة النظرية. في حين توجد العديد من الأدوات الحسابية لحساب الأوزان الجزيئية للبروتين والببتيد ، إلا أنها إما لم تكن مصممة للتطبيق المباشر على كيانات العلاج الحيوي ، أو لديها قيود على الوصول بسبب التراخيص المدفوعة ، أو تتطلب تحميل تسلسلات البروتين إلى خوادم المضيفة. 
لقد طورنا روتينا لحساب الكتلة المعيارية يتيح التحديد السهل للكتل المتوسطة أو أحادية النظائر والتركيبات الأولية للبروتينات السكرية العلاجية ، بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb) والأجسام المضادة ثنائية النوعية (bsAb) واتحادات الأدوية والأجسام المضادة (ADC). ستسمح الطبيعة المعيارية لإطار الحساب المستند إلى Python بتوسيع هذه المنصة لتشمل طرائق أخرى مثل اللقاحات وبروتينات الاندماج وقليل النيوكليوتيدات في المستقبل ، ويمكن أن يكون هذا الإطار مفيدا أيضا لاستجواب بيانات قياس الطيف الكتلي من أعلى إلى أسفل. من خلال إنشاء تطبيق سطح مكتب مستقل مفتوح المصدر بواجهة مستخدم رسومية (GUI) ، نأمل في التغلب على القيود المتعلقة بالاستخدام في البيئات التي لا يمكن فيها تحميل معلومات الملكية إلى الأدوات المستندة إلى الويب. توضح هذه المقالة خوارزميات وتطبيق هذه الأداة ، mAbScale ، على طرق علاجية مختلفة قائمة على الأجسام المضادة.

Over the past two decades, biotherapeutics have evolved to become a mainstay of the modern pharmaceutical industry. The SARS-CoV2 pandemic and other life-threatening conditions have further increased the need for the faster and broader development of biopharmaceutical molecules1,2,3.
The biotherapeutic molecular weight is critical for the identification of the molecule, in combination with other analytical assays. The intact and reduced subunit masses are used throughout the discovery and development lifecycles as part of control strategies aimed at maintaining the quality, as described in the QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Analytical development in the biopharmaceutical industry relies heavily on mass measurements for intact mass analysis and deep characterization using peptide mapping or multi-attribute method (MAM) monitoring. At the center of these techniques utilizing modern mass spectrometry (MS) platforms is the ability to provide high-resolution accurate mass (HR/AM) measurements. Most HR/AM instruments yield mass accuracies in the range of 0.5-5 ppm, which scale with the mass range. The ability to measure masses accurately for intact large molecules enables the quick and confident identification of large-molecule therapeutics. As isotopic resolution cannot be attained using typical experimental conditions for large molecules (&#62;10 kDa), average masses must be calculated for comparison and identification5,6.
A typical intact or subunit protein mass spectrum represents the overall proteoform profile, which contains composite information on the various molecular forms resulting from post-translational modifications (PTM) and any primary structure differences, such as clips or sequence variants. The relatively easy and high-throughput nature of these measurements make them attractive for characterization and as in-process monitoring controls7,8. Data analysis for these experiments usually requires the user to define the search space for molecular forms (range of PTMs or other molecular forms). For glycosylated proteins, this search space is largely driven by glycoform heterogeneity. Combinations of multiple PTMs, disulfide bond configurations, and other variations along the primary structure make calculating all the possible molecular forms a tedious task. Therefore, the manual calculation of the possible molecular forms is a time and resource-consuming process with a high potential for human error.
Here, we present a mass calculation tool that was developed considering the most important features of biotherapeutic molecules, such as mAbs, bsAbs, ADCs, etc. The tool allows the easy incorporation of search-space variables for the consistent calculation of masses and elemental compositions. The modular nature of this tool will enable it to be further developed and applied to mass calculation and mass matching for other modalities.
The GUI module allows the user to specify the input for the mass calculation, as shown in Figure 1; specifically, the user enters single-letter amino acid sequences for light and heavy antibody chains. Common modifications for heavy-chain N-terminal cyclization and C-terminal lysine clipping are included as check boxes. Further, the chemical formula/elemental composition can be added/subtracted from these protein chains through the respective Chem Mod text box. This allows the user the flexibility to add an elemental composition that includes multiple post-translational modifications or a small-molecule payload in the case of an ADC. As most therapeutic mAbs are engineered to remove the glycosylation sites in the light chain, glycosylation in the light chain is left optional and can be specified using a check box on the GUI.
A typical variation on intact mass analysis for antibodies is a reduced subunit mass analysis, where the light chain is detached from the heavy chain by reducing the interchain disulfide bonds. Depending on the strength of the reducing agent used, the intrachain disulfide bonds may or may not be cleaved. The users have the flexibility of entering the total number of disulfide bonds depending on the IgG subtype or in case of a cysteine-conjugated ADC9.
The application calculates masses in a bottom-up manner, in which the elemental compositions are first calculated for the individual heavy chains and light chains. Next, heavy chain (HC) N-terminal cyclization Lys-clipping is accounted for by adjusting the calculated elemental compositions. Any specified chemical modifications are then applied to the heavy and/or light chains. Depending on the type of analysis and the disulfide-bond patterns specified by the user, the number of hydrogens is adjusted for the two polypeptide chains. The glycosylated HC and light chain (LC) (optional) masses are calculated based on the user&#39;s input. Finally, multiple HC and LC masses are combined, and the disulfide bond numbers are automatically updated for the intact mass calculation.
With larger molecules such as intact proteins, monoisotopic masses cannot be measured due to the additive mass defect when using mass spectrometers with typical resolving power. Instead, nominal or average masses are measured or reported5,10,11,12,13. The average elemental masses can vary based on the source used for the curated masses14,15. While the differences in elemental masses may be small, they can add up to significant values for large-molecule molecular weight calculations. The average elemental masses used by default in the software application are shown in Supplementary Table 1. For regulated environments like the biopharmaceutical research and development (R&#38;D) field, it is important to maintain consistent molecular masses because changes in masses may imply changes to the molecular entity during regulatory filings. To enable consistency in the use of elemental masses, a dictionary of elemental masses is included with the software tool as a comma-separated value (csv) text file: Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Similarly, a curated list of glycan compositions typically seen on mAbs is included: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Both files are saved in the same folder location as an executable application and can be modified by the user to use a specific elemental mass list or glycan library.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg" /> 
Figure 1: GUI interface for the mAbScale application. The GUI module allows the user to specify the input for the mass calculation. The user enters single-letter amino acid sequences for the light and heavy antibody chains. Common modifications for the heavy-chain N-terminal cyclization and C-terminal lysine clipping are included as check boxes. Chemical formulas/elemental compositions can be added/subtracted through the respective Chem Mod text box. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير حساب كتلة العلاج الحيوي من خلال تقديم mAbScale ، وهو تطبيق سطح مكتب قائم على Python

إطار مفتوح المصدر لحساب الكتلة للجزيئات العلاجية القائمة على الأجسام المضادة

The challenge with accurate mass calculation for large protein molecules is the mass defect associated with the measurement. As a result, only average masses can be measured. Minor elemental mass differences may accumulate causing significant discrepancies in large paratherapeutic molecules like monoclonal antibodies.Our tool explicitly addresses the challenge in the consistent mass calculation for antibody-based therapeutics, such as MAPs, bispecifics, and antibody drug conjugates. Researchers in the commercial biopharmaceutical development space have to rely on manual calculation or tools that don't depend on communication with external servers due to the involvement of proprietary information. Existing tools either require a license or are not built considering the specific needs of biopharmaceutical development.MapScale offers a user-friendly interface and adaptable open source framework for users and developers. It supports maintaining multiple versions of elemental masses and modification lists, and allows list sharing to maintain consistency in calculations. The code can be shared on an enterprise level using internal servers or cloud-based deployment with controlled access to protect proprietary information.

تم اختيار مجموعة متنوعة من mAbs لتمثيل أنواع مختلفة من mAbs. تم اختيار معيار mAb المتاح تجاريا لتمثيل mAb التقليدي بسلاسل ثقيلة متطابقة وسلاسل ضوئية متطابقة وموقع جليكوزيل واحد مرتبط ب N في منطقة Fc. كما تم اختيار mAb مع غليكوزيل إضافي مرتبط بسلسلة خفيفة N ، و mAb ثنائي النوع ، و mAb مقترن بالأجسام المضا?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Biotherapeutic Mass Calculation by Introducing mAbScale, a Python-Based Desktop Application at JoVE.com

توضح هذه المقالة استخدام تطبيق برمجي، mAbScale، لحساب الكتل لعلاجات البروتين القائمة على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides ...

التحدي مع حساب الكتلة الدقيق لجزيئات البروتين الكبيرة هو عيب الكتلة المرتبط بالقياس. نتيجة لذلك ، يمكن قياس متوسط الكتل فقط. قد تتراكم الاختلافات الطفيفة في الكتلة الأولية مسببة تباينات كبيرة في الجزيئات العلاجية الكبيرة مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.تعالج أداتنا صراحة التحدي في حساب الكتلة المتسق للعلاجات القائمة على الأجسام المضادة ، مثل MAPs ، و bispecifics ، واتحادات أدوية الأجسام المضادة. يتعين على الباحثين في مجال تطوير المستحضرات الصيدلانية الحيوية التجارية الاعتماد على الحساب اليدوي أو الأدوات التي لا تعتمد على الاتصال بالخوادم الخارجية بسبب مشاركة معلومات الملكية. تتطلب الأدوات الحالية إما ترخيصا أو لا يتم بناؤها مع مراعاة الاحتياجات المحددة لتطوير المستحضرات الصيدلانية الحيوية.يوفر MapScale واجهة سهلة الاستخدام وإطار عمل مفتوح المصدر قابل للتكيف للمستخدمين والمطورين. وهو يدعم الحفاظ على إصدارات متعددة من كتل العناصر وقوائم التعديل ، ويسمح بمشاركة القائمة للحفاظ على الاتساق في العمليات الحسابية. يمكن مشاركة التعليمات البرمجية على مستوى المؤسسة باستخدام الخوادم الداخلية أو النشر المستند إلى السحابة مع التحكم في الوصول لحماية معلومات الملكية.

an-open-source-framework-for-mass-calculation-antibody-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

1.2K Views.  GlaxoSmithKline. التحدي مع حساب الكتلة الدقيق لجزيئات البروتين الكبيرة هو عيب الكتلة المرتبط بالقياس. نتيجة لذلك ، يمكن قياس متوسط الكتل فقط. قد تتراكم الاختلافات الطفيفة في الكتلة الأولية مسببة تباينات كبيرة في الجزيئات العلاجية الكبيرة مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.تعالج أداتن?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير حساب كتلة العلاج الحيوي من خلال تقديم mAbScale ، وهو تطبيق سطح مكتب قائم على Python

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides an easy analytical tool for different stages of biopharmaceutical development. The protein's identity is confirmed when the experimental mass from MS is within a pre-defined mass error range of the theoretical mass. While several computational tools exist for the calculation of protein and peptide molecular weights, they either were not designed for direct application to biotherapeutic entities, have access limitations due to paid licenses, or require uploading protein sequences to host servers. 
We have developed a modular mass calculation routine that enables the easy determination of the average or monoisotopic masses and elemental compositions of therapeutic glycoproteins, including monoclonal antibodies (mAb), bispecific antibodies (bsAb), and antibody-drug conjugates (ADC). The modular nature of this Python-based calculation framework will allow the extension of this platform to other modalities such as vaccines, fusion proteins, and oligonucleotides in the future, and this framework could also be useful for the interrogation of top-down mass spectrometry data. By creating an open-source standalone desktop application with a graphical user interface (GUI), we hope to overcome the restrictions around use in environments where proprietary information cannot be uploaded to web-based tools. This article describes the algorithms and application of this tool, mAbScale, to different antibody-based therapeutic modalities.

This article describes the use of a software application, mAbScale, for the calculation of masses for monoclonal antibody-based protein therapeutics.

Running the mAbscale Application to Calculate the Masses of Monoclonal Antibody-Based Protein Therapeutics

To begin, open the software application by double clicking on the icon for an executable file. Enter the heavy chain and light chain sequences in the text boxes under the 1 column without any spaces. For bispecific antibodies, add additional heavy or light chains in the second set of text boxes under the 2 column.Leave these boxes blank for monoclonal antibodies with identical heavy chains and light chains. Check the end terminal cyclization and C terminal clipping check boxes if these heavy chain terminal variants are applicable. Add chemical modifications including linker and payload for antibody drug conjugates to the heavy and light chain chemical modification boxes using elemental compositions such as calcium chloride.These modifications will be added to the respective protein subunit or chain. Specify the number of disulfide bonds in the protein molecules in the text box marked total number of disulfides. Enter the number of unreduced heavy chain disulfide bonds into the unreduced heavy chain disulfides text box and the number of unreduced light chain disulfide bonds into the unreduced light chain disulfides text box depending on the extent of reduction.If glycosylation is present on the monoclonal antibodies light chain, check the light chain is glycosylated check box. Click on the Browse button to select an output folder for the output folder text box and enter the output file name without a file extension into the Excel file no extension text box. Then click on the Submit button.A mass calculation report created message will appear on the screen and the output file can be found in the user designated folder. The app will close automatically. The chemical compositions, calculated masses, measured masses and mass errors of various monoclonal antibodies are summarized in this table.A commercially available monoclonal antibody standard was selected to represent a conventional monoclonal antibody with identical heavy chains, identical light chains, and one N-linked glycosylation site in the FC region. A monoclonal antibody with an additional light chain N-linked glycosylation, a bispecific monoclonal antibody, and an antibody drug conjugate monoclonal antibody were also chosen to widen the application usage. The small mass errors between the calculated masses and measured masses were within the normal mass error acceptance criteria, suggesting that the calculated masses were accurate.