تعتبر المواد الهلامية المستضدية BSA من معايير IHC القابلة للتكرار والتي يمكن أن تكمل الضوابط الحالية. يستخدم هذا البروتوكول علم الأنسجة القياسي وكواشف المدينة العالمية للخدمات الإنسانية وطرق لوضع معايير قابلة للتكرار للتكوين المعروف. توفر هذه الضوابط الفرصة للمختبرات المختلفة لمعايرة وتوحيد مقايسات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية للعديد من الفحوصات ذات الصلة بالتشخيص.
من المهم العثور على مذيب مناسب لإذابة الببتيد أو البروتين. قد يكون من الصعب خلط حلول المستضد والفورمالديهايد بسرعة دون إدخال فقاعات. للبدء ، قم بإعداد 20 ملليلتر من محلول BSA بوزن 25٪ عن طريق خلط خمسة جرامات من مسحوق BSA في 14 ملليلتر من PBS ، في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر حتى يتم توزيعه بالتساوي.
دوامة الحل لإذابة مسحوق BSA. حافظ على المحلول بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية للذوبان الكامل. في اليوم التالي ، اضبط مستوى الصوت النهائي على 20 ملليلتر باستخدام PBS.
وبالمثل ، قم بإعداد 20 ملليلتر من وزن 31.3٪ حسب الحجم محلول BSA عن طريق خلط 6.26 جرام من مسحوق BSA في 13 ملليلتر من PBS. بعد الحضانة بين عشية وضحاها للذوبان الكامل ، اضبط الحجم النهائي على 20 ملليلتر باستخدام PBS. لاختبار أن خليط الفورمالديهايد BSA يشكل هلام ، قم بتسخين كتلة حرارة إلى 85 درجة مئوية.
ثم امزج 700 ميكرولتر من محلول BSA 25٪ مع 700 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪. اخلطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل خمس مرات في غضون خمس إلى 10 ثوان دون إنشاء فقاعات هواء. مباشرة بعد الخلط ، ضع أنبوب الطرد المركزي الصغير المغلق في كتلة الحرارة المسخنة مسبقا إلى 85 درجة مئوية.
بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الأنبوب من كتلة الحرارة. اتركه ليبرد وتأكد من أن الجل قد تشكل كما هو متوقع. قم بإعداد وتسمية ثمانية أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر بوضوح.
ثم قم بإعداد محلول مخزون الببتيد 5x ، أضف تركيزا 12.5 ملليمولار عن طريق تعليق الكتلة الكاملة للببتيد المحرر في 60 ميكرولتر من المذيب المناسب. راقب الحل للتأكد من أن الببتيد يذوب تماما. ثم أضف كمية إضافية من المذيبات حسب الضرورة لصنع محلول 12.5 ملليمولار وفقا للببتيدات الوزن الجزيئي والكتلة والنقاء.
في هذا المثال ، يحتوي مخزون الببتيد 5x على حجم نهائي يبلغ 626.9 ميكرولتر. ستتطلب عينات الببتيد الأخرى حجما نهائيا مختلفا. بعد ذلك ، قم بإعداد 150 ميكرولتر من محلول مخزون الببتيد 1x أضف تركيز 2.5 ملليمولار عن طريق تخفيف 30 ميكرولتر من مخزون الببتيد 5x إلى 120 ميكرولتر من المذيب.
دوامة الحل لمدة خمس ثوان وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد 700 ميكرولتر من محلول BSA الببتيد 0.5 مللي مولم عن طريق تخفيف 140 ميكرولتر من مخزون الببتيد 1x إلى 560 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 31.3٪. بعد الدوامة ، الطرد المركزي الحل في درجة حرارة الغرفة.
وبالمثل ، قم بإعداد أربعة تخفيفات تسلسلية متتالية 10x لمخزون BSA الببتيد عن طريق إضافة 70 ميكرولتر من محلول BSA الببتيد إلى 630 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 25٪. لتحضير المواد الهلامية الببتيد BSA ، أضف 37٪ من الفورمالديهايد إلى تخفيفات الببتيد BSA بنسبة واحدة إلى واحدة تعمل عينة واحدة في كل مرة. اخلطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل خمس مرات في غضون خمس إلى 10 ثوان دون إنشاء فقاعات هواء.
بعد الخلط ، ضع أنبوب الطرد المركزي الصغير المغلق في كتلة حرارية عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تحضير جميع محاليل الببتيد BSA والفورمالديهايد وتسخينها ، اسمح للمواد الهلامية بالبرودة على سطح الطاولة لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، باستخدام ملعقة مختبرية نظيفة ومرنة يمكن التخلص منها ، قم بإزالة عينة الجل من أنبوب الطرد المركزي الصغير في قطعة واحدة.
وضعه في حاوية مغلقة تحتوي على ما لا يقل عن 15 ملليلتر من الفورمالين المحايد المخزن مؤقتا ، باستخدام حاوية منفصلة لكل عينة. بدلا من ذلك ، باستخدام شفرة حلاقة جديدة أحادية الحافة ، قم بقطع الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الصغير ودفع الجل من الأسفل بالهواء أو مسبار مناسب. باستخدام ماكينة حلاقة نظيفة ذات حافة واحدة ، قم بتقليم مخروط الجل إلى أقراص أسطوانية يبلغ سمكها حوالي خمسة ملليمترات.
بعد لف الأقراص في غلاف خزعة، ضع قرص هلام أكبر حجما في كاسيت واحد وأقراص الجل المتبقية معا في كاسيت ثان للاستخدام في بناء المصفوفات الدقيقة للأنسجة. قبل المعالجة ، ضع جل الكاسيت في 15 ملليلتر على الأقل من الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ لكل جل ، باستخدام حاوية منفصلة لكل عينة. بعد ذلك ، قم بمعالجة المواد الهلامية في معالج أنسجة الأنسجة الآلي باتباع جدول زمني كبير للأنسجة مع الضغط والفراغ.
عند اكتمال معالجة العينات، قم بإزالة الكاسيت من معالج الأنسجة وانقلها إلى مركز تضمين البارافين. بعد فك المواد الهلامية من غلاف الخزعة ، قم بتضمين المواد الهلامية في البارافين أو كل عينة قم بتضمين قرص واحد من الجل في قالب صغير 15 × 15 ملم. والأقراص الهلامية المتبقية معا في قالب ثان أكبر.
لكل سلسلة تخفيف الببتيد، قم بإنشاء شريحتين زجاجيتين تحتويان على ما مجموعه ستة أقسام منفصلة. قسم واحد من كل عينة من عينات سلسلة التخفيف الخمسة وقسم واحد من عينة التحكم السلبية BSA فقط. بعد تقسيم الشرائح وتجفيفها ، قم بتلطيخ الشريحتين المحضرتين لكل ببتيد بالجسم المضاد الأساسي المطلوب.
وفقا لبروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية القياسية ، نتوقع رؤية إشارة موحدة نسبيا داخل كل قسم هلامي. مع عينات هلام مختلفة تظهر مجموعة من شدة الإشارة المقابلة لتخفيف الببتيد. بالنسبة لبناء مصفوفة الأنسجة الهلامية BSA ، قم بقطع أربعة أقسام سميكة من المصفوفة الدقيقة للأنسجة ووصمة عار بجسم مضاد وحيد النسيلة للأرانب وفقا للبروتوكولات القياسية المختبرية.
قم بتقييم كثافة البقع الناتجة نوعيا عن طريق الفحص أو شراء مسح الصور الرقمية وتحليلها كميا. بعد التفاعل مع الأجسام المضادة المناسبة ، أظهرت عينات هلام BSA السلبية فقط الحد الأدنى من الإشارة. كثافة الإشارة في عينة هلام فردية موحدة نسبيا وتزداد مع زيادة تركيزات المستضدات.
أكثر من 10٪ من خلايا MDA-MB-175 تظهر باهتة وفي تلطيخ غشائي محيطي تماما. في المقابل ، أكثر من 10 ٪ من خلايا SKBR-3 ، تظهر تلطيخا غشائيا محيطيا مكثفا تماما اعمل بسرعة بمجرد إضافة الفورمالديهايد لأن المحاليل ستبدأ في الهلام حتى في درجة حرارة الغرفة. نحن نستخدم هذه الطريقة لجعل الضوابط IHC عند اختبار الأجسام المضادة الجديدة لمنحنا الثقة بأن الفحص يعمل كما هو متوقع ، حتى عندما لا تظهر الأجسام المضادة للاختبار أي إشارة.
عناصر التحكم في الأنسجة أو خطوط الخلايا متغيرة بطبيعتها. تسمح لنا ضوابط المستضدات الاصطناعية بقياس تأثير تغيير ظروف تفاعل ISD المحددة بشكل أكثر دقة.
