Les auteurs remercient Robert Schuster pour son aide dans la vérification des données.

Le flux de travail de haut niveau pour mAbScale est illustré à la figure 2. Chaque étape a des branches de décision internes plus sophistiquées, des boucles et une combinatoire. Un flux de travail algorithmique détaillé décrivant le processus de calcul est présenté dans la figure supplémentaire 1. La sortie de l’application est enregistrée sous forme de feuille de calcul dans le dossier sélectionné par l’utilisateur. Le fichier de sortie se compose de plusieurs feuilles de calcul distinctes, qui peuvent être classées en tant qu’entrée utilisateur, calculs de poids moléculaire et références pour les dérivations de masse isotopique moyenne (un exemple de sortie est fourni dans des tableaux supplémentaires). Les feuilles de calcul d’entrée de l’utilisateur comprennent les séquences d’acides aminés des protéines et d’autres informations saisies par l’utilisateur, les masses élémentaires moyennes et les masses de glycanes, qui sont utilisées pour calculer la composition élémentaire et les différents poids moléculaires. Les feuilles de calcul de la masse moléculaire comprennent la composition chimique des différentes formes, la masse réduite avec et sans glycosylation et modification chimique, et la masse intacte avec et sans glycosylation et modification chimique. Les feuilles contenant des masses de demi-anticorps seront générées automatiquement si l’utilisateur saisit deux HC différents et/ou deux LC différents dans la page de saisie de l’utilisateur, car les demi-anticorps sont des impuretés primaires qui doivent être identifiées et quantifiées par rapport à l’hétérodimère souhaité. Le code source de mAbScale est accessible via le référentiel suivant : https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg"> Figure 2 : Vue d’ensemble des étapes du calcul des compositions élémentaires et des masses à l’aide de l’application. Le code couleur peut être utilisé pour établir un lien avec le flux de processus décrit dans la figure supplémentaire 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1. Ouverture de l’application mAbscale
<ol><li>Ouvrez l’application logicielle en double-cliquant sur l’icône du fichier exécutable.</li>
</ol>2. Saisie de la séquence
<ol><li>Saisissez les séquences de chaînes lourdes et de chaînes légères dans les zones de texte respectives marquées d’un 1 sans espace.<ol><li>Pour les bsAbs, ajoutez des chaînes lourdes ou légères supplémentaires dans le deuxième ensemble de zones de texte marquées 2. Laissez 2 blancs pour les anticorps monoclonaux avec des chaînes lourdes et des chaînes légères identiques.</li>
		<li>Cochez les cases Cyclisation N-Terminal et/ou Écrêtage C-Terminal, si ces variantes de bornes à chaîne lourde sont applicables.</li>
		<li>Ajoutez toutes les modifications chimiques, y compris l’éditeur de liens et la charge utile pour les molécules ADC, aux zones de texte Heavy Chain Chem Mod et/ou Light Chain Chem Mod.<ol><li>Spécifiez les modifications sous forme de compositions élémentaires, telles que CaCl2. La modification sera ajoutée à la sous-unité ou à la chaîne protéique respective. REMARQUE : Une composition chimique peut également être soustraite d’une sous-unité ou d’une chaîne en préfixant la composition élémentaire par un signe -. Par exemple, -H2O soustraira une molécule d’eau de la composition et de la masse de la sous-unité.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Spécification du nombre de liaisons disulfure
<ol><li>Spécifiez le nombre de liaisons disulfure dans les molécules de protéines dans la zone de texte intitulée Nombre total de disulfures.</li>
	<li>Entrez le nombre de disulfures de HC non réduits dans la zone de texte Sulfures de HC non réduits et le nombre de disulfures de LC non réduits dans la zone de texte Disulfures de LC non réduits , en fonction de l’étendue de la réduction (complète ou partielle). NOTA : L’analyse de masse réduite des sous-unités d’anticorps monoclonaux implique la réduction/séparation des chaînes lourdes et légères liées au disulfure.</li>
	<li>Si une glycosylation est présente sur la chaîne légère anticorps monoclonal, cochez la case La chaîne légère est glycosylée .</li>
</ol>4. Définition du dossier de sortie et exécution de l’application
<ol><li>Cliquez sur le bouton Parcourir pour sélectionner un dossier de sortie pour la zone de texte Dossier de sortie .</li>
	<li>Entrez le nom du fichier de sortie sans extension de fichier (automatiquement enregistré au format .xlsx) dans la zone de texte Fichier Excel (sans ext). </li>
	<li>Cliquez sur le bouton Soumettre pour lancer la demande. Le fichier de sortie se trouve dans le dossier désigné. REMARQUE : Les masses élémentaires et la liste des glycanes peuvent être personnalisées en éditant les fichiers texte délimités Element_Mass.csv (Fichier de codage supplémentaire 1) et Glycane.csv (Fichier de codage supplémentaire 2), respectivement. Ces fichiers doivent être placés dans le même dossier que le fichier exécutable mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) pour que l’application puisse s’exécuter. L’application sera fermée automatiquement après une exécution. L’utilisateur devra redémarrer l’application si un deuxième calcul est nécessaire.</li>
</ol>

Un outil basé sur Python pour le calcul précis de la masse d’entités biothérapeutiques

<ol>
	<li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics.">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li><li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment.">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li><li>Wang, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+biology,+and+structure-based+therapeutics+development.">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018)</li><li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry.">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li><li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies.">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li><li>Beck, A., Sanglier-Cianf&#233;rani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosimilar,+biobetter,+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry.">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li><li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+LC-MS:+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up,+middle-up+and+intact+approaches.">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li><li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules.">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li><li>Jakes, C., F&#252;ssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry.">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li><li>Robotham, A. C., Kelly, J. F., Matte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+-+LC-MS+characterization+of+antibody-based+therapeutics:+Recent+highlights+and+future+prospects.">Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects.</a> Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. , 1-33 (2020).</li><li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li><li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry.">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li><li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+(IUPAC+Technical+Report).">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ame2012+atomic+mass+evaluation.">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li><li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides.">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li><li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry.">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li><li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies:+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods.">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li><li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure,+function+and+therapeutic+potential.">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li><li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine.">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li><li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+site+localization+scoring:+Strategies+and+performance.">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li></ol>

Ce logiciel est publié sous licence Apache 2.0. Droits d’auteur (2022) de GlaxoSmithKline Research & Development Limited. Tous droits réservés. Sous licence Apache, version 2.0 (la « Licence ») ; vous ne pouvez utiliser ce fichier que conformément à la Licence. Vous pouvez obtenir une copie de la Licence à l’adresse http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. Sauf si la loi applicable l’exige ou si cela a été convenu par écrit, les logiciels distribués dans le cadre de la Licence sont distribués « en l’état », sans garantie ni condition d’aucune sorte, expresse ou implicite. Reportez-vous à la Licence pour connaître le langage spécifique régissant les autorisations et les limitations en vertu de la Licence. L.C. est un employé de GlaxoSmithKline (GSK). T.H. et K.K. ont développé ce logiciel en tant qu’employés de GSK et sont maintenant associés de Merck et de Moderna, respectivement.

mAbScale fournit une interface utilisateur intuitive avec la possibilité de modifier les blocs de construction pour les calculs de masse et d’élément. On s’attend à ce que les utilisateurs aient une compréhension de base de la molécule cible pour utiliser l’application, en déduire les masses correctes et interpréter les résultats. Par exemple, la feuille de sortie de masse intacte ou réduite peut être écrasante en raison des nombreuses rangées de masses intactes ou réduites, puisque la base de donnée...

Au cours des deux dernières décennies, les produits biothérapeutiques ont évolué pour devenir un pilier de l’industrie pharmaceutique moderne. La pandémie de SRAS-CoV2 et d’autres maladies potentiellement mortelles ont encore accru la nécessité d’un développement plus rapide et plus large de molécules biopharmaceutiques 1,2,3.
Le poids moléculaire biothérapeutique est critique pour l’identification de la molécule, en combinaison avec d’autres tests analytiques. Les masses de sous-unités intactes et réduites sont utilisées tout au long des cycles de vie de découverte et de développement dans le cadre de stratégies de contrôle visant à maintenir la qualité, comme décrit dans le QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Le développement analytique dans l’industrie biopharmaceutique repose fortement sur les mesures de masse pour l’analyse de la masse intacte et la caractérisation en profondeur à l’aide de la cartographie peptidique ou de la surveillance par méthode multi-attributs (MAM). Au centre de ces techniques utilisant des plates-formes modernes de spectrométrie de masse (MS) se trouve la capacité de fournir des mesures de masse précises à haute résolution (HR/AM). La plupart des instruments HR/AM offrent des précisions de masse comprises entre 0,5 et 5 ppm, qui s’adaptent à la plage de masse. La capacité de mesurer avec précision les masses de grosses molécules intactes permet d’identifier rapidement et en toute confiance les produits thérapeutiques à grandes molécules. Comme la résolution isotopique ne peut pas être atteinte dans des conditions expérimentales typiques pour les grosses molécules (>10 kDa), les masses moyennes doivent être calculées pour la comparaison et l’identification 5,6.
Un spectre de masse protéique intact ou sous-unitaire typique représente le profil protéoforme global, qui contient des informations composites sur les différentes formes moléculaires résultant des modifications post-traductionnelles (PTM) et de toute différence de structure primaire, telle que les clips ou les variantes de séquence. La facilité et le débit relativement élevés de ces mesures les rendent attrayantes pour la caractérisation et les contrôles de surveillance en cours de processus 7,8. L’analyse des données pour ces expériences nécessite généralement que l’utilisateur définisse l’espace de recherche des formes moléculaires (gamme de PTM ou d’autres formes moléculaires). Pour les protéines glycosylées, cet espace de recherche est largement déterminé par l’hétérogénéité des glycoformes. Les combinaisons de plusieurs PTM, de configurations de liaisons disulfure et d’autres variations le long de la structure primaire rendent le calcul de toutes les formes moléculaires possibles fastidieux. Par conséquent, le calcul manuel des formes moléculaires possibles est un processus qui prend du temps et des ressources et qui présente un fort potentiel d’erreur humaine.
Nous présentons ici un outil de calcul de masse qui a été développé en tenant compte des caractéristiques les plus importantes des molécules biothérapeutiques, telles que les anticorps monoclonaux, les bsAb, les ADC, etc. L’outil permet d’incorporer facilement des variables de l’espace de recherche pour le calcul cohérent des masses et des compositions élémentaires. La nature modulaire de cet outil permettra de le développer et de l’appliquer au calcul de masse et à l’appariement de masse pour d’autres modalités.
Le module d’interface graphique permet à l’utilisateur de spécifier l’entrée pour le calcul de la masse, comme illustré à la figure 1 ; Plus précisément, l’utilisateur saisit des séquences d’acides aminés d’une seule lettre pour les chaînes d’anticorps légères et lourdes. Les modifications courantes pour la cyclisation N-terminale à chaîne lourde et l’écrêtage de la lysine C-terminale sont incluses sous forme de cases à cocher. De plus, la formule chimique/la composition élémentaire peut être ajoutée/soustraite de ces chaînes protéiques via la zone de texte Chem Mod correspondante. Cela permet à l’utilisateur d’ajouter une composition élémentaire qui comprend de multiples modifications post-traductionnelles ou une charge utile de petites molécules dans le cas d’un ADC. Comme la plupart des anticorps monoclonaux thérapeutiques sont conçus pour éliminer les sites de glycosylation dans la chaîne légère, la glycosylation dans la chaîne légère est facultative et peut être spécifiée à l’aide d’une case à cocher sur l’interface graphique.
Une variante typique de l’analyse de la masse intacte pour les anticorps est une analyse de masse sous-unitaire réduite, où la chaîne légère est détachée de la chaîne lourde en réduisant les liaisons disulfure interchaînes. Selon la force de l’agent réducteur utilisé, les liaisons disulfure intra-chaîne peuvent être clivées ou non. Les utilisateurs ont la possibilité d’entrer le nombre total de liaisons disulfure en fonction du sous-type d’IgG ou dans le cas d’un ADC9 conjugué à la cystéine.
L’application calcule les masses de manière ascendante, dans laquelle les compositions élémentaires sont d’abord calculées pour les chaînes lourdes et les chaînes légères individuelles. Ensuite, l’écrêtage de Lys de la cyclisation N-terminale à chaîne lourde (HC) est pris en compte en ajustant les compositions élémentaires calculées. Toutes les modifications chimiques spécifiées sont ensuite appliquées aux chaînes lourdes et/ou légères. En fonction du type d’analyse et des modèles de liaison disulfure spécifiés par l’utilisateur, le nombre d’hydrogènes est ajusté pour les deux chaînes polypeptidiques. Les masses glycosylées HC et de chaîne légère (LC) (en option) sont calculées en fonction de l’entrée de l’utilisateur. Enfin, plusieurs masses HC et LC sont combinées, et les numéros de liaison disulfure sont automatiquement mis à jour pour le calcul de la masse intacte.
Avec des molécules plus grosses telles que des protéines intactes, les masses monoisotopiques ne peuvent pas être mesurées en raison du défaut de masse additif lors de l’utilisation de spectromètres de masse avec un pouvoir de résolution typique. Au lieu de cela, les masses nominales ou moyennes sont mesurées ou déclarées 5,10,11,12,13. Les masses élémentaires moyennes peuvent varier en fonction de la source utilisée pour les masses sélectionnées14,15. Bien que les différences dans les masses élémentaires puissent être faibles, elles peuvent s’additionner pour atteindre des valeurs significatives pour les calculs de poids moléculaire de grosses molécules. Les masses élémentaires moyennes utilisées par défaut dans l’application logicielle sont indiquées dans le tableau supplémentaire 1. Pour les environnements réglementés comme le domaine de la recherche et du développement (R-D) biopharmaceutique, il est important de maintenir des masses moléculaires constantes, car les changements de masse peuvent impliquer des changements dans l’entité moléculaire lors des dépôts réglementaires. Pour assurer la cohérence de l’utilisation des masses élémentaires, un dictionnaire des masses élémentaires est inclus avec l’outil logiciel sous la forme d’un fichier texte csv (valeurs séparées par des virgules) : Element_Mass.csv (Fichier de codage supplémentaire 1). De même, une liste organisée des compositions de glycanes généralement observées sur les anticorps monoclonaux est incluse : Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Les deux fichiers sont enregistrés dans le même dossier qu’une application exécutable et peuvent être modifiés par l’utilisateur pour utiliser une liste de masse élémentaire spécifique ou une bibliothèque de glycanes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg"> Figure 1 : Interface graphique de l’application mAbScale. Le module GUI permet à l’utilisateur de spécifier l’entrée pour le calcul de la masse. L’utilisateur saisit des séquences d’acides aminés d’une seule lettre pour les chaînes d’anticorps légères et lourdes. Les modifications courantes pour la cyclisation N-terminale à chaîne lourde et l’écrêtage de la lysine C-terminale sont incluses sous forme de cases à cocher. Les formules chimiques/compositions élémentaires peuvent être ajoutées/soustraites via la zone de texte Chem Mod correspondante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Modular system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody-drug conjugate (ADC)</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Proprietory molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEH 200 SEC column&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>176003904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bispecific mAb</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Proprietory molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Byos</td>
			<td>Protein Metrics, Cupertino, CA</td>
			<td>https://proteinmetrics.com/byos/ 
			Version 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW</td>
			<td>GPMAW</td>
			<td>http://www.gpmaw.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb standard&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>186009125</td>
			<td>Waters Humanized mAb Mass Check Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAbScale</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>Apache License, Version 2.0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Modular system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open-source framework for mass calculation of antibody-based therapeutic molecules

Les masses biothérapeutiques sont un moyen de vérifier l’identité et l’intégrité structurelle. La spectrométrie de masse (MS) de protéines intactes ou de sous-unités protéiques fournit un outil d’analyse facile pour les différentes étapes du développement biopharmaceutique. L’identité de la protéine est confirmée lorsque la masse expérimentale de la MS se situe dans une plage d’erreur de masse prédéfinie par rapport à la masse théorique. Bien qu’il existe plusieurs outils informatiques pour le calcul des poids moléculaires des protéines et des peptides, ils n’ont pas été conçus pour une application directe aux entités biothérapeutiques, ont des limitations d’accès en raison de licences payantes ou nécessitent le téléchargement de séquences protéiques sur des serveurs hôtes. 
Nous avons développé une routine modulaire de calcul de masse qui permet de déterminer facilement les masses moyennes ou monoisotopiques et les compositions élémentaires des glycoprotéines thérapeutiques, y compris les anticorps monoclonaux (mAb), les anticorps bispécifiques (bsAb) et les conjugués anticorps-médicament (ADC). La nature modulaire de ce cadre de calcul basé sur Python permettra d’étendre cette plate-forme à d’autres modalités telles que les vaccins, les protéines de fusion et les oligonucléotides à l’avenir, et ce cadre pourrait également être utile pour l’interrogation des données de spectrométrie de masse descendantes. En créant une application de bureau autonome open source avec une interface utilisateur graphique (GUI), nous espérons surmonter les restrictions liées à l’utilisation dans des environnements où les informations propriétaires ne peuvent pas être téléchargées sur des outils Web. Cet article décrit les algorithmes et l’application de cet outil, mAbScale, à différentes modalités thérapeutiques à base d’anticorps.

Over the past two decades, biotherapeutics have evolved to become a mainstay of the modern pharmaceutical industry. The SARS-CoV2 pandemic and other life-threatening conditions have further increased the need for the faster and broader development of biopharmaceutical molecules1,2,3.
The biotherapeutic molecular weight is critical for the identification of the molecule, in combination with other analytical assays. The intact and reduced subunit masses are used throughout the discovery and development lifecycles as part of control strategies aimed at maintaining the quality, as described in the QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Analytical development in the biopharmaceutical industry relies heavily on mass measurements for intact mass analysis and deep characterization using peptide mapping or multi-attribute method (MAM) monitoring. At the center of these techniques utilizing modern mass spectrometry (MS) platforms is the ability to provide high-resolution accurate mass (HR/AM) measurements. Most HR/AM instruments yield mass accuracies in the range of 0.5-5 ppm, which scale with the mass range. The ability to measure masses accurately for intact large molecules enables the quick and confident identification of large-molecule therapeutics. As isotopic resolution cannot be attained using typical experimental conditions for large molecules (&#62;10 kDa), average masses must be calculated for comparison and identification5,6.
A typical intact or subunit protein mass spectrum represents the overall proteoform profile, which contains composite information on the various molecular forms resulting from post-translational modifications (PTM) and any primary structure differences, such as clips or sequence variants. The relatively easy and high-throughput nature of these measurements make them attractive for characterization and as in-process monitoring controls7,8. Data analysis for these experiments usually requires the user to define the search space for molecular forms (range of PTMs or other molecular forms). For glycosylated proteins, this search space is largely driven by glycoform heterogeneity. Combinations of multiple PTMs, disulfide bond configurations, and other variations along the primary structure make calculating all the possible molecular forms a tedious task. Therefore, the manual calculation of the possible molecular forms is a time and resource-consuming process with a high potential for human error.
Here, we present a mass calculation tool that was developed considering the most important features of biotherapeutic molecules, such as mAbs, bsAbs, ADCs, etc. The tool allows the easy incorporation of search-space variables for the consistent calculation of masses and elemental compositions. The modular nature of this tool will enable it to be further developed and applied to mass calculation and mass matching for other modalities.
The GUI module allows the user to specify the input for the mass calculation, as shown in Figure 1; specifically, the user enters single-letter amino acid sequences for light and heavy antibody chains. Common modifications for heavy-chain N-terminal cyclization and C-terminal lysine clipping are included as check boxes. Further, the chemical formula/elemental composition can be added/subtracted from these protein chains through the respective Chem Mod text box. This allows the user the flexibility to add an elemental composition that includes multiple post-translational modifications or a small-molecule payload in the case of an ADC. As most therapeutic mAbs are engineered to remove the glycosylation sites in the light chain, glycosylation in the light chain is left optional and can be specified using a check box on the GUI.
A typical variation on intact mass analysis for antibodies is a reduced subunit mass analysis, where the light chain is detached from the heavy chain by reducing the interchain disulfide bonds. Depending on the strength of the reducing agent used, the intrachain disulfide bonds may or may not be cleaved. The users have the flexibility of entering the total number of disulfide bonds depending on the IgG subtype or in case of a cysteine-conjugated ADC9.
The application calculates masses in a bottom-up manner, in which the elemental compositions are first calculated for the individual heavy chains and light chains. Next, heavy chain (HC) N-terminal cyclization Lys-clipping is accounted for by adjusting the calculated elemental compositions. Any specified chemical modifications are then applied to the heavy and/or light chains. Depending on the type of analysis and the disulfide-bond patterns specified by the user, the number of hydrogens is adjusted for the two polypeptide chains. The glycosylated HC and light chain (LC) (optional) masses are calculated based on the user&#39;s input. Finally, multiple HC and LC masses are combined, and the disulfide bond numbers are automatically updated for the intact mass calculation.
With larger molecules such as intact proteins, monoisotopic masses cannot be measured due to the additive mass defect when using mass spectrometers with typical resolving power. Instead, nominal or average masses are measured or reported5,10,11,12,13. The average elemental masses can vary based on the source used for the curated masses14,15. While the differences in elemental masses may be small, they can add up to significant values for large-molecule molecular weight calculations. The average elemental masses used by default in the software application are shown in Supplementary Table 1. For regulated environments like the biopharmaceutical research and development (R&#38;D) field, it is important to maintain consistent molecular masses because changes in masses may imply changes to the molecular entity during regulatory filings. To enable consistency in the use of elemental masses, a dictionary of elemental masses is included with the software tool as a comma-separated value (csv) text file: Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Similarly, a curated list of glycan compositions typically seen on mAbs is included: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Both files are saved in the same folder location as an executable application and can be modified by the user to use a specific elemental mass list or glycan library.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg" /> 
Figure 1: GUI interface for the mAbScale application. The GUI module allows the user to specify the input for the mass calculation. The user enters single-letter amino acid sequences for the light and heavy antibody chains. Common modifications for the heavy-chain N-terminal cyclization and C-terminal lysine clipping are included as check boxes. Chemical formulas/elemental compositions can be added/subtracted through the respective Chem Mod text box. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser le calcul de la masse biothérapeutique en introduisant mAbScale, une application de bureau basée sur Python

Un framework open-source pour le calcul de la masse de molécules thérapeutiques à base d’anticorps

The challenge with accurate mass calculation for large protein molecules is the mass defect associated with the measurement. As a result, only average masses can be measured. Minor elemental mass differences may accumulate causing significant discrepancies in large paratherapeutic molecules like monoclonal antibodies.Our tool explicitly addresses the challenge in the consistent mass calculation for antibody-based therapeutics, such as MAPs, bispecifics, and antibody drug conjugates. Researchers in the commercial biopharmaceutical development space have to rely on manual calculation or tools that don't depend on communication with external servers due to the involvement of proprietary information. Existing tools either require a license or are not built considering the specific needs of biopharmaceutical development.MapScale offers a user-friendly interface and adaptable open source framework for users and developers. It supports maintaining multiple versions of elemental masses and modification lists, and allows list sharing to maintain consistency in calculations. The code can be shared on an enterprise level using internal servers or cloud-based deployment with controlled access to protect proprietary information.

Une variété d’anticorps monoclonaux a été sélectionnée pour représenter différents types d’anticorps monoclonaux. Un étalon d’anticorps monoclonaux disponible dans le commerce a été choisi pour représenter un anticorps monoclonal conventionnel avec des chaînes lourdes identiques, des chaînes légères identiques et un site de glycosylation lié à l’azote dans la région Fc. Un anticorps monoclonal avec une glycosylation supplémentaire liée à l’azote à chaîne légère, un anticorps monoclonal...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Biotherapeutic Mass Calculation by Introducing mAbScale, a Python-Based Desktop Application at JoVE.com

Cet article décrit l’utilisation d’une application logicielle, mAbScale, pour le calcul des masses pour les protéines thérapeutiques à base d’anticorps monoclonaux.

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides ...

Le défi d’un calcul précis de la masse pour les grosses molécules de protéines est le défaut de masse associé à la mesure. Par conséquent, seules les masses moyennes peuvent être mesurées. Des différences mineures de masse élémentaire peuvent s’accumuler, provoquant des écarts importants dans les grandes molécules parathérapeutiques comme les anticorps monoclonaux.Notre outil répond explicitement au défi du calcul cohérent de la masse pour les thérapies à base d’anticorps, telles que les MAP, les bispécifiques et les conjugués anticorps-médicaments. Les chercheurs dans le domaine du développement biopharmaceutique commercial doivent s’appuyer sur des calculs manuels ou des outils qui ne dépendent pas de la communication avec des serveurs externes en raison de l’implication d’informations exclusives. Les outils existants nécessitent une licence ou ne sont pas conçus en tenant compte des besoins spécifiques du développement biopharmaceutique.MapScale offre une interface conviviale et un cadre open source adaptable pour les utilisateurs et les développeurs. Il prend en charge la gestion de plusieurs versions de masses élémentaires et de listes de modification, et permet le partage de listes pour maintenir la cohérence des calculs. Le code peut être partagé au niveau de l’entreprise à l’aide de serveurs internes ou d’un déploiement basé sur le cloud avec un accès contrôlé pour protéger les informations propriétaires.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

1.2K vues.  GlaxoSmithKline. Le défi d’un calcul précis de la masse pour les grosses molécules de protéines est le défaut de masse associé à la mesure. Par conséquent, seules les masses moyennes peuvent être mesurées. Des différences mineures de masse élémentaire peuvent s’accumuler, provoquant des écarts importants dans les grandes molécules parathérapeutiques comme les anticorps monoclonaux.Notre outil répond explicitement au défi du calcul cohérent de la masse pour les thérapies à base ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser le calcul de la masse biothérapeutique en introduisant mAbScale, une application de bureau basée sur Python

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides an easy analytical tool for different stages of biopharmaceutical development. The protein's identity is confirmed when the experimental mass from MS is within a pre-defined mass error range of the theoretical mass. While several computational tools exist for the calculation of protein and peptide molecular weights, they either were not designed for direct application to biotherapeutic entities, have access limitations due to paid licenses, or require uploading protein sequences to host servers. 
We have developed a modular mass calculation routine that enables the easy determination of the average or monoisotopic masses and elemental compositions of therapeutic glycoproteins, including monoclonal antibodies (mAb), bispecific antibodies (bsAb), and antibody-drug conjugates (ADC). The modular nature of this Python-based calculation framework will allow the extension of this platform to other modalities such as vaccines, fusion proteins, and oligonucleotides in the future, and this framework could also be useful for the interrogation of top-down mass spectrometry data. By creating an open-source standalone desktop application with a graphical user interface (GUI), we hope to overcome the restrictions around use in environments where proprietary information cannot be uploaded to web-based tools. This article describes the algorithms and application of this tool, mAbScale, to different antibody-based therapeutic modalities.

This article describes the use of a software application, mAbScale, for the calculation of masses for monoclonal antibody-based protein therapeutics.

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Biochimie

Running the mAbscale Application to Calculate the Masses of Monoclonal Antibody-Based Protein Therapeutics

To begin, open the software application by double clicking on the icon for an executable file. Enter the heavy chain and light chain sequences in the text boxes under the 1 column without any spaces. For bispecific antibodies, add additional heavy or light chains in the second set of text boxes under the 2 column.Leave these boxes blank for monoclonal antibodies with identical heavy chains and light chains. Check the end terminal cyclization and C terminal clipping check boxes if these heavy chain terminal variants are applicable. Add chemical modifications including linker and payload for antibody drug conjugates to the heavy and light chain chemical modification boxes using elemental compositions such as calcium chloride.These modifications will be added to the respective protein subunit or chain. Specify the number of disulfide bonds in the protein molecules in the text box marked total number of disulfides. Enter the number of unreduced heavy chain disulfide bonds into the unreduced heavy chain disulfides text box and the number of unreduced light chain disulfide bonds into the unreduced light chain disulfides text box depending on the extent of reduction.If glycosylation is present on the monoclonal antibodies light chain, check the light chain is glycosylated check box. Click on the Browse button to select an output folder for the output folder text box and enter the output file name without a file extension into the Excel file no extension text box. Then click on the Submit button.A mass calculation report created message will appear on the screen and the output file can be found in the user designated folder. The app will close automatically. The chemical compositions, calculated masses, measured masses and mass errors of various monoclonal antibodies are summarized in this table.A commercially available monoclonal antibody standard was selected to represent a conventional monoclonal antibody with identical heavy chains, identical light chains, and one N-linked glycosylation site in the FC region. A monoclonal antibody with an additional light chain N-linked glycosylation, a bispecific monoclonal antibody, and an antibody drug conjugate monoclonal antibody were also chosen to widen the application usage. The small mass errors between the calculated masses and measured masses were within the normal mass error acceptance criteria, suggesting that the calculated masses were accurate.