وتستخدم الأجسام المضادة بشكل روتيني في تقنيات المختبرات وتطبيقاتها العلاجية والتشخيصية تتوسع بسرعة. توصيف ربط الأجسام المضادة للأجسام المضادة سريع ودقيق مهم للغاية لهذه التطبيقات. يقيس القياس الضوئي الشامل بسرعة تقارب الربط باستخدام كميات صغيرة للغاية من المواد.
ولا يلزم وضع العلامات أو الجمود، ويمكن الحصول على معلومات عن نقاء البروتينات وإضفاء الطابع النقّي عليها من التجربة نفسها. يمكن استخدام هذا البروتوكول ليس فقط لدراسة الأجسام المضادة ، ولكن أيضًا لقياس الارتباطات القوية للبروتين والبروتين للبروتينات ذات الكتلة الجزيئية الأكبر من 50 كيلو دالات. تبدأ باستخدام ملقط لينة تلميح وزجاجات غسل لشطف بالتسلسل 24 من 50 ملليمتر يغطي من أعلى إلى أسفل مع الماء المقطر والإيثانول والماء المقطر، ايزوبروبانول، والماء المقطر.
بعد الغسيل الأخير، جفف الأغطية مع تيار من النيتروجين النظيف في نفس الاتجاه لتجنب نقل التلوث من ملقط. شطف 24 في 24 ملليمتر يغطي مع الماء المقطر والإيثانول كما هو موضح، تليها التجفيف مع تيار من النيتروجين نظيفة. بعد التجفيف، ضع غطاء 24 في 24 ملليمتر على قطعة من رقائق الألومنيوم ووضع شرائط من الشريط على الوجهين على غطاء.
ثم قطع 24 من 24 ملليمتر يغطي من احباط واضغط بلطف احباط على الجانب العامل من 24 من 50 ملليمتر coverslip. لإعداد عينات مستضد الأجسام لقياسات التقارب، قم بفرز ما لا يقل عن ملليلترين من PBS من خلال فلتر حقنة 0.22 ميكرون لإزالة جزيئات الغبار والمجاميع، والطرد المركزي مخزون الأجسام المضادة والمستضدات ذات الاهتمام. قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر من أرصدة الأجسام المضادة ومضادات لتحديد تركيزاتها الفعلية، وإعداد سلسلة المعايرة من خليط مضاد الأجسام في النطاق المناسب من تركيزات مستضد في حجم النهائي من 50 ميكرولتر لكل عينة.
ثم احتضان خليط الأجسام المضادة للضد لمدة 10 دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة للسماح للتفاعل ملزمة للوصول إلى التوازن الكيميائي. لتقييم تقارب الأجسام المضادة المضادة بواسطة القياس الضوئي الشامل ، قم بتطبيق قطرة زيت الغمر بالمجهر على هدف الأداة ووضع غرفة التدفق على خشبة مسرح المجهر. إضافة 10 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها إلى نهاية واحدة من قناة غرفة التدفق.
سيدخل المخزن المؤقت القناة بواسطة إجراء شعري. في علامة التبويب التحكم البؤري لبرنامج تجميع البيانات، استخدم أزرار حركة المرحلة الخشنة لأعلى ولللأسفل لإجراء التعديلات الأولية والنقر على الحدة لعرض قراءة إشارة الحدة. استخدم أزرار الضبط لأعلى ولفلة لتعظيم قيمة الحدة وانقر فوق ضبط التركيز والتركيز على التركيز لتنشيط وظيفة تتبع التركيز البؤري.
يجب أن يكون لصورة الشريحة النظيفة قيمة إشارة تساوي أو أقل من 0.05٪ تحميل 20 ميكرولترات من أول عينة مستضد الأجسام كما هو موضح، النشاف السائل من الطرف الآخر مع قطعة صغيرة من الورق النشاف. فور التحميل، انقر فوق سجل للحصول على العدد المناسب من الإطارات ما يعادل 100 ثانية من البيانات. في نهاية فترة تجميع البيانات، أدخل اسم ملف للبيانات وانقر فوق موافق، ثم قم بأخذ عينة لحفظ الملف.
لتحليل بيانات القياس الضوئي الشامل، افتح الملف الذي يهمك وانقر فوق التحليل. انقر فوق تحميل لتحميل وظيفة المعايرة وانقر فوق ملف وحفظ النتائج لحفظ البيانات تحليلها. للحصول على التركيزات النسبية لكل نوع في العينة، افتح الأحداث.
CSV ملف، نسخ البيانات في العمود M في برنامج التخطيط والتحليل المناسب، واستخدام الرسم البياني الرسم البياني لرسم توزيع الكتلة الجزيئية. انقر نقراً مزدوجاً فوق الرسم البياني لفتح نافذة خصائص الرسم، وتعطيل binning التلقائي، وحدد حجم سلة من 2.5 كيلودالتون. لإنشاء مراكز الحاويات وعدد البيانات، انقر فوق تطبيق والذهاب.
لملاءمة الرسم البياني مع وظائف جاوسي، حدد مراكز الحاويات و تحسب الأعمدة وانقر فوق قمم التحليلات ووظيفة قائمة الاحتواء المتعددة للذروة الأساسية. انقر نقراً مزدوجاً للإشارة إلى مواضع الذروة التقريبية على الرسم توزيع وانقر فوق فتح NL صالح. تحقق من مربعات الاختيار الثابتة لمراكز الذروة XC وتعيين قيمها على الكتل الجزيئية المتوقعة من الأجسام المضادة الحرة ومجمعات الأجسام المضادة المضادة المفردة والمزدوجة.
تحقق من خيار المشاركة لمعلمات العرض وانقر فوق احتواء. وتمثل قيم ارتفاع الذروة المجهزة لمكونات الغاوسية التركيز النسبي لكل نوع في العينة. ثم استخدم المعادلة لحساب جزء تركيز كل نوع من قيم ذروة الارتفاع.
لحساب ثوابت التوازن باستخدام برنامج جدول بيانات، افتح التحلل. ورقة عمل xlsx. في ورقة العمل هذه، يمكن تعديل قيم الخلايا المميزة باللون الأصفر في الصفوف من 1 إلى 10 لإجراء عمليات حسابية ثابتة للتوازن.
أدخل قيم ثابت التحلل المقدر في وحدات نانوموللار في الخلايا B1 و B2. إذا لم تكن قيم ثابت الانفصام المقدر معروفة، اترك القيم الافتراضية في الخلايا B1 و B2 دون تغيير. أدخل مجموع الأجسام المضادة ومجموع تركيزات المستضدات في وحدات نانوموللار في الخلايا D2 و E2 وأدخل قيم الكسر المحسوبة لكل نوع في الخلايا F2 وG2 و H2. عند إجراء التحليل العمومي المعايرة، أضف قيم كسر البيانات المناسبة في الصفوف من 2 إلى 10. في إطار معلمات solver، حدد الخلية B15 لمربع الهدف المحدد والخلايا B1 إلى B2 عن طريق تغيير الخلايا المتغيرة.
حدد زر الحد الأدنى للخيار إلى وتحقق من جعل المتغيرات غير المقيدة غير سالبة مربع، ثم حدد GRG غير الخطية كأسلوب حل وانقر فوق حل. سيتم عرض القيم الثابتة للتفكك المناسب في الخلايا B1 و B2. وسيتم عرض مجموع النهائي من الأخطاء التربيعية في الخلية B15. في هذه التجربة التمثيلية، تم تنفيذ سلسلة المعايرة مع الأجسام المضادة مضادة بشرية خافض في تركيز 25 نانومولير ثابت و0، 7.5، 15، 30، 60، و 120 نانومولار الإنسان ألفا ثرومبين تركيزات تم إجراءها للحصول على التوزيعات الكتلة الجزيئية من المخاليط المضادة للجسم و 15، 30، 60، و 120 نانومولار الإنسان ألفا ثرومبين تركيزات تم تنفيذها للحصول على التوزيعات الكتلة الجزيئية من مستضد الأجسام المضادة و عينة الأجسام المضادة فقط.
تم تطبيع أفضل المعلمات ذروة الارتفاع تناسب من المكونات غاوسي للحصول على كسور تركيز الأنواع. ثم كانت قيم كسر التركيز ملائمة على الصعيد العالمي للحصول على تقاربات الربط بين الأجسام المضادة المضادة. ويمكن بعد ذلك رسم كسور التركيز التجريبية ونتائج الملاءمة العالمية للأجسام المضادة الحرة، ومجمع مستضد واحد، ومجمع مستضد مزدوج.
للحصول على قيم دقيقة KD، يجب اختيار تركيزات البروتين بعناية لملء جميع أنواع التفاعل. نوصي بإعداد سلسلة المعايرة باستخدام مجموعة من تركيزات المستضد. بعد تركيب البيانات، يمكن استخدام أسلوب إسقاط الخطأ للحصول على خطأ المناسب، ولكن من الأفضل تكرار التجربة وحساب الانحرافات المعيارية لقيم التقارب الربط المتوسط.
