يتم دعم هذا العمل بمنح من (1) البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2020YFE0201600) ؛ (2) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408) ؛ (3) مركز شنغهاي للابتكار التعاوني للتحول الصناعي لإعداد الطب الصيني التقليدي للمستشفى ؛ (4) المشاريع البحثية في حدود ميزانية جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (2021LK047).

انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. يوضح الشكل 1 البروتوكول العام لأسماك الحمض النووي الريبي. يحتوي الجدول 1 على تكوين جميع الحلول ويحتوي الجدول 2 على تسلسلات التمهيدي المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إعداد التحقيق
<ol><li>تحديد والحصول على تسلسل FASTA لهدف lncRNA ذي الأهمية ، على سبيل المثال ، من GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). باتباع المؤشرات الموجودة على موقع الويب ، صمم مجسات ISH عبر الإنترنت19 ، وراجع اقتراحات خوارزمية التصميم لسرد المجسات التي سيتم طلبها باستخدام ملصق Cy3.</li>
	<li>احتضان المخزن المؤقت للتهجين عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مقدما.</li>
	<li>قم بإذابة 4 مسبار كثافة بصرية (OD) في 160 ميكرولتر من ddH2O المعالج بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) بتركيز 1 مجم / مل بعيدا عن الضوء. ملاحظة: تمثل الكثافة الضوئية (OD) وحدة قياس الحمض النووي والحمض النووي الريبي. عادة ، 1 وحدة OD = 33 ميكروغرام / مل من الحمض النووي.</li>
	<li>قم بإعداد 200 ميكرولتر من خليط المسبار لكل بئر (1.2 ميكرولتر -10 ميكرولتر من المسبار ، 70 ميكرولتر من محلول التهجين ، قم بتكوين الحجم باستخدام ddH2O المعالج ب DEPC إلى 200 ميكرولتر) ، وقم بإعداد سلسلة من 50 ميكروغرام / مل ، 25 ميكروغرام / مل ، 12.5 ميكروغرام / مل ، و 6 ميكروغرام / مل. ملاحظة: يجب استكشاف تركيز المسبار تجريبيا مسبقا. سيؤدي تركيز المسبار العالي إلى ارتباط غير محدد ل lncRNAs ، بينما سيؤدي تركيز المسبار المنخفض إلى اكتشاف غير حساس أو فاشل ل lncRNAs.</li>
	<li>قم بتعكير مزيج المسبار على حرارة 73 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ملاحظة: إذا كان مسبار الحمض النووي المسمى Cy3 مزدوج الشريط ، فقم بفك طبيعة المسبار إلى الحمض النووي أحادي الشريط عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم يبرد بسرعة لمدة 2 دقيقة على الجليد.</li>
</ol>2. إعداد الخلية
<ol><li>بذر 50000 خلية 143B لكل بئر على أغطية زجاجية معقمة في صفيحة استزراع خلايا مكونة من 12 بئرا واحتضانها لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) في DMEM. ملاحظة: يختلف رقم الخلية المحدد المصنف هنا باختلاف حجم الخلية ، وهو مناسب للخلايا المصنفة للوصول إلى التقاء بنسبة 50٪ بعد حضنها لمدة 24 ساعة. أغطية الزجاج المعقمة مستديرة لتكون مناسبة للوحة 12 بئرا.</li>
	<li>قم بإزالة الوسط واغسله لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). ملاحظة: قم بإعداد 1x PBS مع DDH2O. المعالج ب DEPC لا يمكن استخدام PBS بدون علاج DEPC لأنه يحتوي على RNase. قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في ظروف خالية من RNase.</li>
	<li>قم بإزالة 1x PBS وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ في كل بئر لإصلاحه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإزالة الإيثانول ، وأضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X-100 (في 1x PBS) في كل بئر ، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يجب التحكم في الوقت بشكل صارم باستخدام نفاذية Triton X-100 ولا يمكن أن يكون طويلا جدا.</li>
	<li>إزالة 0.1٪ تريتون X-100 وغسل 2 × 5 دقائق مع 1x PBS. ملاحظة: إذا كان لا بد من إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، فاستبدل PBS بإيثانول 70٪ (تخفيف الإيثانول بنسبة 100٪ باستخدام ddH2O الخالي من RNase) وقم بتخزين العينة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.</li>
	<li>قم بإزالة 1x PBS ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول سترات محلول ملحي الصوديوم (SSC) (تخفيف 20x SSC مع DDH2O الخالي من RNase) في كل بئر ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بإزالة 2x SSC buffer ، وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ في كل بئر ، واحتضانها لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تخلص من الإيثانول بنسبة 70٪ ، وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 85٪ (تخفيف الإيثانول بنسبة 100٪ مع ddH2O الخالي من RNase) في كل بئر ، واحتضانه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تخلص من الإيثانول بنسبة 85٪ ، وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ في كل بئر ، واحتضن لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>امتصاص وتجاهل الإيثانول 100 ٪. دع الآبار تجف.</li>
</ol>3. التهجين الفلوري في الموقع (FISH)
<ol><li>أضف 200 ميكرولتر من خليط المسبار (مشوه كما في الخطوة 1.5) إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل (16-18 ساعة). ملاحظة: هناك علاقة إيجابية قوية بين درجة حرارة التهجين وتركيز المسبار. لذلك ، لتحسين الخلفية ، يجب تقليل درجة حرارة التهجين وتركيز المسبار.</li>
	<li>في اليوم التالي ، أخرج عينات من 37 درجة مئوية وتخلص من خليط المسبار. أضف 200 ميكرولتر من 0.4x SSC / 0.3٪ Tween-20 buffer إلى كل بئر (مسخن مسبقا عند 65 درجة مئوية) واغسله لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإزالة المخزن المؤقت 0.4x SSC / 0.3٪ Tween-20 ، وأضف 200 ميكرولتر من 2x SSC / 0.1٪ Tween-20 buffer إلى كل بئر ، واغسله لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإزالة 2x SSC / 0.1٪ Tween-20 buffer ، أضف 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 ميكروغرام / مل) ، وصمة عار لمدة 20 دقيقة بعيدا عن الضوء.</li>
	<li>تخلص من محلول صبغة DAPI واغسله باستخدام 1x PBS لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من وسط التثبيت الذي يحتوي على العلكة على الشريحة وضع الغطاء الزجاجي على الشريحة لإصلاحها. ملاحظة: تأكد من وضع شريحة الغطاء على الشريحة بحيث يكون جانب الخلية لأسفل.</li>
	<li>مراقبة تحت المجهر مضان. ملاحظة: استخدام المجهر مضان أو المجهر البؤري الليزر; هذا الأخير ينتج حساسية أعلى ووضوح التصوير.</li>
</ol>

FISH لتوطين الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر في خلايا الساركوما العظمية البشرية

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression.">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation,+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346.">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li><li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation,+migration,+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells.">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li><li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function.">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li><li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer.">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a/RASSF6+axis.">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li><li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K/AKT+pathway.">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ceRNA+in+cancer:+possible+functions+and+clinical+implications.">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li><li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells.">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy.">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a/b+and+miR-214+in+colorectal+cancer.">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 12 (1), 3 (2019).</li><li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p.">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li><li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p/ULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma.">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82 (2019).</li><li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li><li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids.">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells.">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li><li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples.">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+RNA+FISH+(smFISH)+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs.">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

لا يمكن لبروتوكول RNA FISH هذا اكتشاف توطين lncRNAs في الخلايا فحسب ، بل يمكنه أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى في الخلايا ، والتي يمكن استخدامها أيضا للكشف عن موقع lncRNAs في الأنسجة المضمنة بالبارافين. ومع ذلك ، فإن البروتوكول المحدد في مثل هذه ا...

لقد تم توسيع فهمنا للجينوم البشري بشكل كبير من خلال التطورات الحديثة في تكنولوجيا الجينوم الكامل. يمكن نسخ حوالي 93٪ من الجينوم البشري إلى الحمض النووي الريبي ، ولكن يمكن ترجمة 2٪ فقط من الحمض النووي الريبي إلى بروتينات. تسمى 98٪ المتبقية من الحمض النووي الريبي التي ليس لها وظيفة ترجمة البروتين الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNA) 1. كفئة من الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNAs) ، جذبت ncRNAs الطويلة (lncRNAs) ، التي تحتوي على أكثر من 200 نيوكليوتيدات2 ، اهتماما متزايدا بسبب مشاركتها في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية للخلايا ، مثل التمايز ، والتحكم في الدورة ، وموت الخلايا المبرمج ، والهجرة ، والغزو3،4،5. تلعب LncRNAs أدوارها من خلال آليات مختلفة ، مثل تنظيم بنية الكروماتين والتعبير الجيني النووي ، والتحكم في عملية ربط mRNA ، وتعديل ما بعد النسخ6. تنظم LncRNAs حدوث الأورام الخبيثة وتطورها وانتشارها على مستوى النسخ وما بعد النسخ. يتم تحقيق تنظيم النسخ في النواة من خلال التأثير على نسخ الحمض النووي الريبي عن طريق الارتباط بالهياكل الكروموسومية ، بينما يتحقق تنظيم ما بعد النسخ في السيتوبلازم عن طريق التحكم في الجينات المستهدفة عبر آلية RNA تنافسية داخلية المنشأ (ceRNA)5،7،8. كشف CeRNA عن آلية جديدة لتفاعل الحمض النووي الريبي ، وهي أن lncRNAs يمكن أن تعمل كإسفنجة لامتصاص miRNAs وتثبيط التدهور بوساطة miRNA للجينات المستهدفة ذات الصلة9. لذلك ، فإن المعلومات المتعلقة بالتوطين تحت الخلوي ل lncRNAs ، سواء كان lncRNA معينا موجودا في السيتوبلازم أو النواة ، مهمة للمساعدة في تحديد وظائفها البيولوجية.
في الوقت الحاضر ، يتم الكشف عن توطين lncRNA بشكل أساسي بطريقتين ، واحدة عن طريق مقايسة عزل جزء النواة / السيتوبلازم ، والأخرى بواسطة RNA FISH. في السابق ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي في السيتوبلازم والكسور النووية على التوالي ، ثم يتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات lncRNA محددة للكشف عن نسبة lncRNAs في السيتوبلازم والنواة. ميزة هذه الطريقة هي كفاءة الوقت ، في حين أن العيب هو أن توطين lncRNA الفعلي لا ينعكس مباشرة من خلال النسبة النسبية ل lncRNAs في السيتوبلازم والنواة. يمكن ل RNA FISH اكتشاف توطين lncRNA في الخلايا من خلال تصميم تسلسلات سلسلة مضادة للحساسية خاصة ب lncRNA متبوعة بوضع العلامات باستخدام أصباغ الفلورسنت10. تم تحسين طرق RNA FISH مع التقدم في تقنيات المسبار وطرق الكشف ، بما في ذلك مجموعات مسبار oligo المتعددة ذات العلامات الفلوروفور 11 ، ومجسات LNA12 ، ومجسات الحمض النووي المتفرعة (bDNA)13. لا يمكن ل RNA FISH اكتشاف توطين lncRNA فحسب ، بل يمكنه أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى باستخدام التألق المناعي مزدوج اللون أو متعدد الألوان14.
في هذا العمل ، قمنا بتضمين بروتوكول الكشف عن التوطين المفصل داخل الخلايا للجين المضيف للحمض النووي الريبي الصغير lncRNA 6 (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية (143B) بواسطة RNA FISH كمثال. SNHG6 هو 600-730 نيوكليوتيد lncRNA في شكله الناضج المقسم ويتم تحديده على أنه جين ورمي جديد في سرطانات بشرية متنوعة ، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم وسرطان المعدة وسرطان الخلايا الصافية المبيض وساركوما العظام وسرطان الخلايا الكبدية15،16،17،18. أكدت الدراسات تورط SNHG6 في السلوكيات البيولوجية للخلايا السرطانية ، مثل الانتشار ، EMT ، والالتهام الذاتي ، وأظهرت توطين السيتوبلازم ل SNHG6 حيث قد يؤثر على الجينات المستهدفة عن طريق ربط (إسفنجة) miRNAs15،16،17. يتم تقديم بروتوكول الكشف التفصيلي هذا للتوطين داخل الخلايا SNHG6 بواسطة RNA FISH هنا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>IC1000</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate-12</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>3513,corning</td>
			<td>Place the coverslips in the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cell line (143B)</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td>osteosarcoma cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>&#160;430790, Corning</td>
			<td>Centrifuge the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>abs7026</td>
			<td>The cells are seeded on the coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td>
			<td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td>
			<td>A10005</td>
			<td>Detect SNHG6 location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>LM-E1141</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>DKT200-2&#160;</td>
			<td>Incubation at different high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td>
			<td>Observation and positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td>
			<td>DHP-9051</td>
			<td>The samples were incubated at 37 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E675004</td>
			<td>Attach the coverslips to the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>TS-8S</td>
			<td>Washing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>188105</td>
			<td>The coverslips is placed on the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600198</td>
			<td>Permeable membrane and nuclear membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypsin (0.25%)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>25200056, Gibco</td>
			<td>trypsin treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600560</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna fluorescence in situ hybridization for long non-coding rna localization in human osteosarcoma cells

تمت دراسة الأدوار المهمة للحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) في السرطان ، مثل تنظيم الانتشار ، والانتقال الظهاري الوسيطة (EMT) ، والهجرة ، والتسلل ، والالتهام الذاتي للخلايا السرطانية. يمكن أن يوفر اكتشاف توطين lncRNAs في الخلايا نظرة ثاقبة لوظائفها. من خلال تصميم تسلسل سلسلة مضادات الحساسية الخاصة ب lncRNA متبوعا بوضع العلامات باستخدام أصباغ الفلورسنت ، يمكن تطبيق مضان الحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) للكشف عن التوطين الخلوي ل lncRNAs. جنبا إلى جنب مع تطوير الفحص المجهري ، تسمح تقنيات RNA FISH الآن بتصور lncRNAs التي تم التعبير عنها بشكل سيئ. لا يمكن لهذه الطريقة اكتشاف توطين lncRNAs وحدها فحسب ، بل يمكنها أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى باستخدام التألق المناعي مزدوج اللون أو متعدد الألوان. هنا ، قمنا بتضمين إجراء التشغيل التجريبي التفصيلي واحتياطات RNA FISH باستخدام الجين المضيف للحمض النووي الريبي lncRNA الصغير 6 (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية البشرية (143B) كمثال ، لتوفير مرجع للباحثين الذين يرغبون في إجراء تجارب RNA FISH ، وخاصة lncRNA FISH.

Our understanding of the human genome has been greatly expanded by recent advances in whole-genome technology. About 93% of the human genome can be transcribed into RNAs, but only 2% of the RNAs can be translated into proteins; the remaining 98% of RNAs that have no protein translation function are called non-coding RNA (ncRNA)1. As a class of noncoding RNAs (ncRNAs), long ncRNAs (lncRNAs), containing over 200 nucleotides2, have attracted increasing attention due to their involvement in many physiological and pathological processes of the cells, such as differentiation, cycle control, apoptosis, migration, and invasion3,4,5. LncRNAs play their roles through various mechanisms, such as regulating chromatin structure and nuclear gene expression, controlling the mRNA splicing process, and posttranscriptional modification6. LncRNAs regulate the occurrence, development, and metastasis of malignancies at both the transcriptional and posttranscriptional levels. Transcriptional regulation is realized in the nucleus by affecting RNA transcription via binding to the chromosomal structures, while posttranscriptional regulation is realized in the cytoplasm by controlling the target genes via an endogenous competitive RNA (ceRNA) mechanism5, 7, 8. CeRNA has revealed a new mechanism of RNA interaction, namely that lncRNAs can act as a sponge to adsorb miRNAs and inhibit the miRNA-mediated degradation of related target genes9. Therefore, the information regarding the subcellular localization of lncRNAs, whether a specific lncRNA is located in the cytoplasm or nucleus, is important to help identify their biological functions.
At present, lncRNA localization is mainly detected by two methods, one is by nucleus/cytoplasm fraction isolation assay, and the other is by RNA FISH. In the former, RNAs in the cytoplasmic and the nuclear fractions are extracted respectively, and then PCR amplification is performed with specific lncRNA primers to detect the ratio of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. The advantage of this method is time efficiency, while the disadvantage is that the actual lncRNA localization is not directly reflected by the relative proportion of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. RNA FISH can detect lncRNA localization in cells through the design of lncRNA-specific antisense chain sequences followed by labeling with fluorescent dyes10. The RNA FISH methods have been improved with advances in probe techniques and detection methods, including fluorophore-labeled multiple oligo probe sets11, LNA probes12, and branched-DNA (bDNA) probes13. RNA FISH can not only detect the localization of lncRNA, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence14.
In this work, we have included the detailed intracellular localization detection protocol of lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in osteosarcoma cells (143B) by RNA FISH as an example. SNHG6 is a 600-730 nucleotide lncRNA in its mature spliced form and identified as a novel oncogene in diverse human cancers, including colorectal cancer, gastric cancer, ovarian clear cell carcinoma, osteosarcoma, and hepatocellular carcinoma15,16,17,18. Studies have confirmed the involvement of SNHG6 in biological behaviors of cancer cells, such as proliferation, EMT, and autophagy, and shown the cytoplasmic localization of SNHG6 where it may affect the target genes by binding (sponging) the miRNAs15,16,17. This detailed detection protocol of SNHG6 intracellular localization by RNA FISH is presented herein.

تسليط الضوء على المؤلف: RNA FISH لتحديد موقع lncRNA-SNHG6 في خلايا الساركوما العظمية 

مضان الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين لتوطين الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر في خلايا الساركوما العظمية البشرية

The scope of our research is to provide a detailed RNA FISH protocol that's providing a reference for scientists who want to perform RNA FISH experiments. Our research has established that RNA FISH can be used to localize lncRNA in human osteosarcoma cells. Our protocol provided a comprehensive experimental procedure and the precautions for RNA FISH using lncRNA-SNHG6 in human osteosarcoma cells as a reference.

يتم عرض صور تمثيلية ل SNHG6 FISH في خلايا الساركوما العظمية البشرية (الشكل 2). يتم التعامل مع عنصر التحكم السلبي باستخدام مسبار Ctrl السلبي ؛ يتم التعامل مع التحكم الإيجابي باستخدام مسبار U6 20. يتم تمييز مسبار SNHG6 ومسبار U6 ب Cy3 ، الذي ينبعث منه مضان أحمر. DAPI هي صبغة تلطخ ا?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA FISH for Locating lncRNA-SNHG6 in Osteosarcoma Cells at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول طريقة مضان الحمض النووي الريبي في الموقع للتهجين لتوطين lncRNAs في خلايا الساركوما العظمية البشرية.

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

يتمثل نطاق بحثنا في توفير بروتوكول RNA FISH مفصل يوفر مرجعا للعلماء الذين يرغبون في إجراء تجارب RNA FISH. أثبت بحثنا أنه يمكن استخدام RNA FISH لتوطين lncRNA في خلايا الساركوما العظمية البشرية. قدم بروتوكولنا إجراء تجريبيا شاملا واحتياطات ل RNA FISH باستخدام lncRNA-SNHG6 في خلايا الساركوما العظمية البشرية كمرجع.

rna-fluorescence-situ-hybridization-for-long-non-coding-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

1.0K Views.  Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. يتمثل نطاق بحثنا في توفير بروتوكول RNA FISH مفصل يوفر مرجعا للعلماء الذين يرغبون في إجراء تجارب RNA FISH. أثبت بحثنا أنه يمكن استخدام RNA FISH لتوطين lncRNA في خلايا الساركوما العظمية البشرية. قدم بروتوكولنا إجراء تجريبيا شاملا واحتياطات ل RNA FISH باستخدام lncRNA-SNHG6 في خلايا الساركوما العظمي...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: RNA FISH لتحديد موقع lncRNA-SNHG6 في خلايا الساركوما العظمية 

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), migration, infiltration, and autophagy of cancer cells. Localization detection of lncRNAs in cells can provide insight into their functions. By designing the lncRNA-specific antisense chain sequence followed by labeling with fluorescent dyes, RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be applied to detect the cellular localization of lncRNAs. Together with the development of microscopy, the RNA FISH techniques now even allow for visualization of the poorly expressed lncRNAs. This method can not only detect the localization of lncRNAs alone, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence. Here, we have included the detailed experimental operation procedure and precautions of RNA FISH by using lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in human osteosarcoma cells (143B) as an example, to provide a reference for researchers who want to perform RNA FISH experiments, especially lncRNA FISH.

The present protocol describes a method of RNA fluorescence in situ hybridization to localize the lncRNAs in human osteosarcoma cells.

RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Localize the lncRNAs in Human Osteosarcoma Cells

To begin, after acquiring the long non-coding RNA of interest, incubate the hybridization buffer at 37 degrees Celsius for two hours. Next, dissolve the four optical density probe in 160 microliters of diethyl pyrocarbonate treated deionized water away from the light. Prepare 200 microliters of the probe mixture for each well, and set up a series of 50, 25, 12.5, and six micrograms per milliliter.Denature the probe mix at 73 degrees Celsius for five minutes. Take a 12-well cell culture plate containing 143B cells on sterile glass cover slips. Remove the medium and wash twice for five minutes with PBS.Place the cells on a shaker. Then remove the PBS and add 200 microliters of 100%ethanol to each well, fixing for 15 minutes at room temperature. Then remove the ethanol, add 200 microliters of 0.1%Triton X-100 to each well, and incubate for 15 minutes at room temperature.Remove 0.1%Triton X-100 and wash two times for five minutes with PBS. Next, remove PBS, add 200 microliters of two times sodium-saline citrate or SSC buffer into each well, and incubate for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Remove two times SSC buffer, add 200 microliters of 70%ethanol into each well, and incubate for three minutes at room temperature.Discard the 70%ethanol, then add 200 microliters of 85%ethanol into each well and incubate for three minutes at room temperature. Next, discard the 85%ethanol, add 200 microliters of 100%ethanol to each well, and incubate for three minutes at room temperature. Afterward, absorb and discard the 100%ethanol and allow the wells to dry.Next, add 200 microliters of denatured probe mixture to each well, then incubate at 37 degrees Celsius overnight. The following day, remove samples from 37 degrees Celsius, discard the probe mixture, and add 200 microliters of preheated 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Remove the 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer.Add 200 microliters of two times SSC 0.1%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Next, discard the two times SSC 0.1%Tween 20 buffer. Add 200 microliters of DAPI staining solution and stain for 20 minutes in the dark on a shaker.After staining, discard the DAPI solution and wash it with PBS for two minutes at room temperature. Lastly, add 50 microliters of mounting medium containing gum to the slide and place the glass cover slip to fix the slide. Representative SNHG6 FISH images in human osteosarcoma cells are shown.SNHG6 probe labeled with Cy3, which emits red fluorescence, showed that SNHG6 is mainly localized in the cytoplasm. A background color was observed when using a high concentration of probe.