이 연구는 (1) 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2020YFE0201600)의 보조금으로 지원됩니다. (2) 국립자연과학재단(National Nature Science Foundation, 81973877 및 82174408) (3) 병원 TCM 준비의 산업 전환의 상하이 협력 혁신 센터; (4) Shanghai University of Traditional Chinese Medicine 예산 내 연구 프로젝트(2021LK047).

이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 그림 1 은 RNA FISH에 대한 전체 프로토콜을 보여줍니다. 표 1 에는 모든 용액의 조성이 포함되어 있고 표 2 에는 이 프로토콜에 사용된 프라이머 서열이 포함되어 있습니다.
1. 프로브 준비
<ol><li>예를 들어 GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에서 관심 표적 lncRNA의 FASTA 염기서열을 식별하고 획득합니다. 웹 사이트의 표시에 따라 온라인으로 ISH 프로브를 설계하고19 설계 알고리즘의 제안을 검토하여 Cy3 라벨로 주문할 프로브를 나열합니다.</li>
	<li>혼성화 완충액을 37°C에서 2시간 전에 배양합니다.</li>
	<li>4 광학 밀도(OD) 프로브를 160μL의 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리된 ddH2O에 1mg/mL 농도로 빛에서 멀리 떨어뜨립니다. 참고: 광학 밀도(OD)는 DNA와 RNA의 측정 단위를 나타냅니다. 일반적으로 1 OD 단위 = 33 μg/mL DNA.</li>
	<li>각 웰에 대해 200μL의 프로브 혼합물(프로브 1.2μL-10μL, 혼성화 완충액 70μL, DEPC 처리된 ddH 2O 내지 200μL로 부피 구성)을 준비하고, 50μg/mL, 25μg/mL, 12.5μg/mL 및 6μg/mL 시리즈를 설정합니다. 알림: 프로브 농도는 사전에 실험적으로 탐색해야 합니다. 높은 프로브 농도는 lncRNA의 비특이적 결합으로 이어지고, 낮은 프로브 농도는 lncRNA의 둔감하거나 검출 실패로 이어집니다.</li>
	<li>프로브 혼합물을 73°C에서 5분 동안 변성시킵니다. 참고: Cy3 표지 DNA 프로브가 이중 가닥인 경우 프로브를 95°C에서 5분 동안 단일 가닥 DNA로 변성시킨 다음 얼음에서 2분 동안 빠르게 냉각합니다.</li>
</ol>2. 세포 준비
<ol><li>12웰 세포 배양 플레이트의 멸균 유리 커버슬립에 웰당 50,000개의 143B 세포를 파종하고 DMEM에서 24시간(37°C, 5% CO2) 동안 배양합니다. 참고: 여기에 파종된 특정 세포 수는 세포 크기에 따라 다르며, 이는 파종된 세포가 24시간 동안 배양된 후 50%의 합류점에 도달하는 데 적합합니다. 멸균 유리 커버슬립은 12웰 플레이트에 적합하도록 둥글게 되어 있습니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 2x 인산염 완충 식염수(PBS)로 5 x 1분 동안 세척합니다. 참고: DEPC 처리된 ddH2O로 PBS 1개를 준비합니다. DEPC 처리가 없는 PBS는 RNase를 함유하고 있기 때문에 사용할 수 없습니다. RNase가 없는 조건에서 다음 단계를 모두 수행합니다.</li>
	<li>1x PBS를 제거하고 각 웰에 200μL의 100% 에탄올을 추가하여 실온에서 15분 동안 고정합니다.</li>
	<li>에탄올을 제거하고 각 웰에 200μL의 0.1% Triton X-100(1x PBS 기준)을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 참고: 시간은 Triton X-100 투과성으로 엄격하게 제어해야 하며 너무 길어서는 안 됩니다.</li>
	<li>0.1% Triton X-100을 제거하고 1x PBS로 2 x 5분 동안 세척합니다. 참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지해야 하는 경우 PBS를 70% 에탄올로 교체하고(100% 에탄올을 RNase가 없는 ddH2O로 희석) 샘플을 4°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다.</li>
	<li>1x PBS를 제거하고, 200μL의 2x 식염수 나트륨(SSC) 완충액(RNase가 없는 ddH 2O로20xSSC 희석)을 각 웰에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>2x SSC 버퍼를 제거하고 각 웰에 200μL의 70% 에탄올을 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 버리고 200μL의 85% 에탄올(RNase가 없는 ddH2O로 100% 에탄올 희석)을 각 웰에 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>85% 에탄올을 버리고 각 웰에 200μL의 100% 에탄올을 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>100% 에탄올을 흡수하고 버리십시오. 우물을 말리십시오.</li>
</ol>3. 형광 in situ hybridization (FISH)
<ol><li>200μL의 프로브 혼합물(1.5단계에서와 같이 변성됨)을 각 웰에 추가하고 37°C에서 밤새 배양합니다(16-18시간). 알림: 혼성화 온도와 프로브 농도 사이에는 강한 양의 상관 관계가 있습니다. 따라서 배경을 최적화하려면 혼성화 온도와 프로브 농도를 모두 줄여야 합니다.</li>
	<li>다음날 37 °C에서 샘플을 꺼내 프로브 혼합물을 폐기합니다. 각 웰에 0.4x SSC/0.3% Tween-20 완충액 200μL를 추가하고(65°C에서 예열) 실온에서 2분 동안 세척합니다.</li>
	<li>0.4x SSC/0.3% Tween-20 완충액을 제거하고 각 웰에 2x SSC/0.1% Tween-20 완충액 200μL를 추가한 다음 실온에서 2분 동안 세척합니다.</li>
	<li>2x SSC/0.1% 트윈-20 버퍼를 제거하고 200μL의 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 염색 용액(1μg/mL)을 추가하고 빛을 피해 20분 동안 염색합니다.</li>
	<li>DAPI 염료 용액을 버리고 실온에서 1x PBS로 2분 동안 세척합니다.</li>
	<li>슬라이드에 껌이 들어 있는 장착 매체 50μL를 추가하고 유리 커버슬립을 슬라이드에 올려 고정합니다. 알림: 커버슬립은 셀 면이 아래로 향하게 하여 슬라이드에 놓아야 합니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 관찰하십시오. 알림: 형광 현미경 또는 레이저 컨포칼 현미경을 사용하십시오. 후자는 더 높은 감도와 선명도 이미징을 생성합니다.</li>
</ol>

인간 골육종 세포에서 Long Non-coding RNA 국소화를 위한 FISH

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression.">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation,+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346.">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li><li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation,+migration,+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells.">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li><li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function.">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li><li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer.">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a/RASSF6+axis.">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li><li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K/AKT+pathway.">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ceRNA+in+cancer:+possible+functions+and+clinical+implications.">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li><li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells.">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy.">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a/b+and+miR-214+in+colorectal+cancer.">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 12 (1), 3 (2019).</li><li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p.">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li><li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p/ULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma.">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82 (2019).</li><li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li><li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids.">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells.">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li><li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples.">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+RNA+FISH+(smFISH)+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs.">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).</li></ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 RNA FISH 프로토콜은 세포에서 lncRNA의 국소화를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 세포에서 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화를 검출할 수 있으며, 이는 파라핀 포매 조직에서 lncRNA의 위치를 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 경우에서의 구체적인 프로토콜은 상이한데, 그 이유는 파라핀-포매 조직이 탈왁스될 필요가 있기 때문이다21. 이 실험 절차는 48웰 또...

인간 게놈에 대한 우리의 이해는 최근 전체 게놈 기술의 발전으로 크게 확장되었습니다. 인간 게놈의 약 93%는 RNA로 전사될 수 있지만 RNA의 2%만 단백질로 번역될 수 있습니다. 단백질 번역 기능이 없는 나머지 98%의 RNA를 non-coding RNA(ncRNA)라고 합니다1. 200개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 긴 ncRNA(noncoding RNA(ncRNA)의 한 종류인 긴 ncRNA(lncRNA)는 분화, 주기 조절, 세포자멸사, 이동 및 침습과 같은 세포의 많은 생리학적 및 병리학적 과정에 관여하기 때문에 점점 더 주목을 받고 있습니다 3,4,5. LncRNA는 염색질 구조 및 핵 유전자 발현 조절, mRNA 접합 과정 제어, 전사 후 변형 등 다양한 메커니즘을 통해 역할을 수행합니다6. LncRNA는 전사 및 전사 후 수준 모두에서 악성 종양의 발생, 발달 및 전이를 조절합니다. 전사 조절은 염색체 구조에 대한 결합을 통해 RNA 전사에 영향을 미침으로써 핵에서 실현되는 반면, 전사 후 조절은 내인성 경쟁 RNA(ceRNA) 메커니즘을 통해 표적 유전자를 제어하여 세포질에서 실현됩니다 5,7,8. CeRNA는 RNA 상호 작용의 새로운 메커니즘, 즉 lncRNA가 miRNA를 흡착하고 관련 표적 유전자의 miRNA 매개 분해를 억제하는 스폰지 역할을 할 수 있음을 밝혔습니다9. 그러므로, lncRNAs의 subcellular 국소화에 관하여 정보는, 특정한 lncRNA가 세포질 또는 핵에서 있다는 것을, 그들의 생물학 기능을 확인하는 것을 돕도록 중요합니다.
현재 lncRNA 국소화는 주로 두 가지 방법으로 검출되는데, 하나는 핵/세포질 분획 분리 분석에 의한 것이고 다른 하나는 RNA FISH에 의한 것입니다. 전자에서는 세포질 및 핵 분획의 RNA를 각각 추출한 다음 특정 lncRNA 프라이머로 PCR 증폭을 수행하여 세포질과 핵에서 lncRNA의 비율을 검출합니다. 이 방법의 장점은 시간 효율성인 반면, 단점은 실제 lncRNA 국소화가 세포질과 핵에서 lncRNA의 상대적 비율에 의해 직접 반영되지 않는다는 것입니다. RNA FISH는 형광 염료10으로 표지한 후 lncRNA 특이적 안티센스 사슬 서열의 설계를 통해 세포에서 lncRNA 국소화를 검출할 수 있습니다. RNA FISH 분석법은 형광단 표지된 다중 올리고 프로브 세트(11), LNA 프로브(12) 및 분지형 DNA(bDNA) 프로브(13)를 포함한 프로브 기술 및 검출 방법의 발전으로 개선되었습니다. RNA FISH는 lncRNA의 국소화를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 이중색 또는 다색 면역형광을 사용하여 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화도 검출할 수 있습니다14.
이 연구에서는 RNA FISH에 의한 골육종 세포(143B)에서 lncRNA small nucleolar RNA host gene 6(SNHG6)의 상세한 세포 내 국소화 검출 프로토콜을 예로 포함했습니다. SNHG6는 성숙한 접합 형태의 600-730 뉴클레오티드 lncRNA이며 대장암, 위암, 난소 투명 세포 암종, 골육종 및 간세포 암종을 포함한 다양한 인간 암에서 새로운 종양 유전자로 확인되었습니다15,16,17,18. 연구에 따르면 SNHG6는 증식, EMT 및 자가포식과 같은 암세포의 생물학적 행동에 관여하는 것으로 확인되었으며, miRNA15,16,17에 결합(스폰지)하여 표적 유전자에 영향을 미칠 수 있는 SNHG6의 세포질 국소화를 보여주었습니다. RNA FISH에 의한 SNHG6 세포내 국소화의 상세한 검출 프로토콜이 본원에 제시되어 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>IC1000</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate-12</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>3513,corning</td>
			<td>Place the coverslips in the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cell line (143B)</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td>osteosarcoma cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>&#160;430790, Corning</td>
			<td>Centrifuge the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>abs7026</td>
			<td>The cells are seeded on the coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td>
			<td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td>
			<td>A10005</td>
			<td>Detect SNHG6 location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>LM-E1141</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>DKT200-2&#160;</td>
			<td>Incubation at different high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td>
			<td>Observation and positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td>
			<td>DHP-9051</td>
			<td>The samples were incubated at 37 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E675004</td>
			<td>Attach the coverslips to the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>TS-8S</td>
			<td>Washing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>188105</td>
			<td>The coverslips is placed on the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600198</td>
			<td>Permeable membrane and nuclear membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypsin (0.25%)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>25200056, Gibco</td>
			<td>trypsin treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600560</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna fluorescence in situ hybridization for long non-coding rna localization in human osteosarcoma cells

암세포의 증식, 상피-중간엽 전이(EMT), 이동, 침투 및 자가포식을 조절하는 것과 같은 암에서 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 중요한 역할이 연구되었습니다. 세포에서 lncRNA의 국소화 검출은 세포의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 형광 염료로 표지한 후 lncRNA 특이적 안티센스 사슬 서열을 설계함으로써 RNA 형광 in situ hybridization(FISH)을 적용하여 lncRNA의 세포 국소화를 검출할 수 있습니다. 현미경 검사법의 발달과 함께, RNA 물고기 기술은 지금 잘 표현되지 않는 lncRNAs의 구상 조차 허용합니다. 이 방법은 lncRNA의 국소화를 단독으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라 이중색 또는 다색 면역형광을 사용하여 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화도 검출할 수 있습니다. 여기에서는 인간 골육종 세포(143B)에서 lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6)을 예로 들어 RNA FISH의 상세한 실험 조작 절차 및 주의사항을 포함하여, RNA FISH 실험, 특히 lncRNA FISH를 수행하고자 하는 연구자들에게 참고자료를 제공하였다.

Our understanding of the human genome has been greatly expanded by recent advances in whole-genome technology. About 93% of the human genome can be transcribed into RNAs, but only 2% of the RNAs can be translated into proteins; the remaining 98% of RNAs that have no protein translation function are called non-coding RNA (ncRNA)1. As a class of noncoding RNAs (ncRNAs), long ncRNAs (lncRNAs), containing over 200 nucleotides2, have attracted increasing attention due to their involvement in many physiological and pathological processes of the cells, such as differentiation, cycle control, apoptosis, migration, and invasion3,4,5. LncRNAs play their roles through various mechanisms, such as regulating chromatin structure and nuclear gene expression, controlling the mRNA splicing process, and posttranscriptional modification6. LncRNAs regulate the occurrence, development, and metastasis of malignancies at both the transcriptional and posttranscriptional levels. Transcriptional regulation is realized in the nucleus by affecting RNA transcription via binding to the chromosomal structures, while posttranscriptional regulation is realized in the cytoplasm by controlling the target genes via an endogenous competitive RNA (ceRNA) mechanism5, 7, 8. CeRNA has revealed a new mechanism of RNA interaction, namely that lncRNAs can act as a sponge to adsorb miRNAs and inhibit the miRNA-mediated degradation of related target genes9. Therefore, the information regarding the subcellular localization of lncRNAs, whether a specific lncRNA is located in the cytoplasm or nucleus, is important to help identify their biological functions.
At present, lncRNA localization is mainly detected by two methods, one is by nucleus/cytoplasm fraction isolation assay, and the other is by RNA FISH. In the former, RNAs in the cytoplasmic and the nuclear fractions are extracted respectively, and then PCR amplification is performed with specific lncRNA primers to detect the ratio of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. The advantage of this method is time efficiency, while the disadvantage is that the actual lncRNA localization is not directly reflected by the relative proportion of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. RNA FISH can detect lncRNA localization in cells through the design of lncRNA-specific antisense chain sequences followed by labeling with fluorescent dyes10. The RNA FISH methods have been improved with advances in probe techniques and detection methods, including fluorophore-labeled multiple oligo probe sets11, LNA probes12, and branched-DNA (bDNA) probes13. RNA FISH can not only detect the localization of lncRNA, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence14.
In this work, we have included the detailed intracellular localization detection protocol of lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in osteosarcoma cells (143B) by RNA FISH as an example. SNHG6 is a 600-730 nucleotide lncRNA in its mature spliced form and identified as a novel oncogene in diverse human cancers, including colorectal cancer, gastric cancer, ovarian clear cell carcinoma, osteosarcoma, and hepatocellular carcinoma15,16,17,18. Studies have confirmed the involvement of SNHG6 in biological behaviors of cancer cells, such as proliferation, EMT, and autophagy, and shown the cytoplasmic localization of SNHG6 where it may affect the target genes by binding (sponging) the miRNAs15,16,17. This detailed detection protocol of SNHG6 intracellular localization by RNA FISH is presented herein.

저자 스포트라이트: 골육종 세포에서 lncRNA-SNHG6를 찾기 위한 RNA FISH 

인간 골육종 세포에서 긴 비코딩 RNA 국소화를 위한 RNA Fluorescence In Situ Hybridization

The scope of our research is to provide a detailed RNA FISH protocol that's providing a reference for scientists who want to perform RNA FISH experiments. Our research has established that RNA FISH can be used to localize lncRNA in human osteosarcoma cells. Our protocol provided a comprehensive experimental procedure and the precautions for RNA FISH using lncRNA-SNHG6 in human osteosarcoma cells as a reference.

인간 골육종 세포에서 SNHG6 FISH의 대표적인 이미지가 표시됩니다(그림 2). 네거티브 컨트롤은 네거티브 Ctrl 프로브로 처리됩니다. 양성 대조군은 U6 프로브 20으로 처리됩니다. SNHG6 프로브와 U6 프로브는 적색 형광을 방출하는 Cy3로 표지되어 있습니다. DAPI는 청색 형광을 방출하는 DNA를 염색하는 염료입니다. 이 결과는 SNHG6가 주로 세포질에 국한되어 있음을 ?...

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본 프로토콜은 인간 골육종 세포에서 lncRNA를 국소화하기 위한 RNA 형광 in situ 교잡의 방법을 기술한다.

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

우리 연구의 범위는 RNA FISH 실험을 수행하려는 과학자들에게 참조를 제공하는 상세한 RNA FISH 프로토콜을 제공하는 것입니다. 우리의 연구는 RNA FISH가 인간 골육종 세포에서 lncRNA를 국소화하는 데 사용될 수 있음을 확인했습니다. 당사의 프로토콜은 인간 골육종 세포에서 lncRNA-SNHG6를 참조로 사용하여 RNA FISH에 대한 포괄적인 실험 절차와 예방 조치를 제공했습니다.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

1.0K 조회수.  Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. 우리 연구의 범위는 RNA FISH 실험을 수행하려는 과학자들에게 참조를 제공하는 상세한 RNA FISH 프로토콜을 제공하는 것입니다. 우리의 연구는 RNA FISH가 인간 골육종 세포에서 lncRNA를 국소화하는 데 사용될 수 있음을 확인했습니다. 당사의 프로토콜은 인간 골육종 세포에서 lncRNA-SNHG6를 참조로 사용하여 RNA FISH에 대한 포괄적인 실험 절차와 예방 조치를 제공했습니다.

비디오: 저자 스포트라이트: 골육종 세포에서 lncRNA-SNHG6를 찾기 위한 RNA FISH 

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), migration, infiltration, and autophagy of cancer cells. Localization detection of lncRNAs in cells can provide insight into their functions. By designing the lncRNA-specific antisense chain sequence followed by labeling with fluorescent dyes, RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be applied to detect the cellular localization of lncRNAs. Together with the development of microscopy, the RNA FISH techniques now even allow for visualization of the poorly expressed lncRNAs. This method can not only detect the localization of lncRNAs alone, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence. Here, we have included the detailed experimental operation procedure and precautions of RNA FISH by using lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in human osteosarcoma cells (143B) as an example, to provide a reference for researchers who want to perform RNA FISH experiments, especially lncRNA FISH.

The present protocol describes a method of RNA fluorescence in situ hybridization to localize the lncRNAs in human osteosarcoma cells.

연구

암 연구학

RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Localize the lncRNAs in Human Osteosarcoma Cells

To begin, after acquiring the long non-coding RNA of interest, incubate the hybridization buffer at 37 degrees Celsius for two hours. Next, dissolve the four optical density probe in 160 microliters of diethyl pyrocarbonate treated deionized water away from the light. Prepare 200 microliters of the probe mixture for each well, and set up a series of 50, 25, 12.5, and six micrograms per milliliter.Denature the probe mix at 73 degrees Celsius for five minutes. Take a 12-well cell culture plate containing 143B cells on sterile glass cover slips. Remove the medium and wash twice for five minutes with PBS.Place the cells on a shaker. Then remove the PBS and add 200 microliters of 100%ethanol to each well, fixing for 15 minutes at room temperature. Then remove the ethanol, add 200 microliters of 0.1%Triton X-100 to each well, and incubate for 15 minutes at room temperature.Remove 0.1%Triton X-100 and wash two times for five minutes with PBS. Next, remove PBS, add 200 microliters of two times sodium-saline citrate or SSC buffer into each well, and incubate for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Remove two times SSC buffer, add 200 microliters of 70%ethanol into each well, and incubate for three minutes at room temperature.Discard the 70%ethanol, then add 200 microliters of 85%ethanol into each well and incubate for three minutes at room temperature. Next, discard the 85%ethanol, add 200 microliters of 100%ethanol to each well, and incubate for three minutes at room temperature. Afterward, absorb and discard the 100%ethanol and allow the wells to dry.Next, add 200 microliters of denatured probe mixture to each well, then incubate at 37 degrees Celsius overnight. The following day, remove samples from 37 degrees Celsius, discard the probe mixture, and add 200 microliters of preheated 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Remove the 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer.Add 200 microliters of two times SSC 0.1%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Next, discard the two times SSC 0.1%Tween 20 buffer. Add 200 microliters of DAPI staining solution and stain for 20 minutes in the dark on a shaker.After staining, discard the DAPI solution and wash it with PBS for two minutes at room temperature. Lastly, add 50 microliters of mounting medium containing gum to the slide and place the glass cover slip to fix the slide. Representative SNHG6 FISH images in human osteosarcoma cells are shown.SNHG6 probe labeled with Cy3, which emits red fluorescence, showed that SNHG6 is mainly localized in the cytoplasm. A background color was observed when using a high concentration of probe.