يود المؤلفون الاعتراف بالعديد من المساهمات في هذا المجال التي لم يتم ذكرها في هذا العمل بسبب قيود المساحة ، وكذلك وكالات التمويل التي أتاحت هذه الفرصة. يقر المؤلفون بالتمويل المقدم من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) ، التي دعمت هذا العمل. حصل KM على منحة CGS-M من NSERC ومنحة Killam للدكتوراه من جامعة كولومبيا البريطانية. N.S. هو الحائز على جائزة مايكل سميث للبحوث الصحية BC Scholar.

1. إعداد الكواشف لثقافة mPSC
<ol><li>تحضير ملحق N2.<ol><li>في الظروف غير المعقمة، قم بإعداد محاليل المخزون التالية (الخطوة 1.1.1.1) في غطاء دخان السلامة الكيميائية. أضف المسحوق الصلب لكل مادة كيميائية إلى أنبوب مخروطي الوزن مسبقا سعة 50 مل. وزن كل أنبوب بعد إضافة المسحوق وإضافة كمية مناسبة من المذيب لتحقيق التركيزات أدناه. بالنسبة لدفعة واحدة من الوسائط ، قم بإعداد الحد الأدنى للمبلغ المدرج. ملاحظة: الكواشف التالية خطرة ويجب التعامل معها وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المحلية. تأكد من معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند المناولة ، واعمل فقط مع أشكال المسحوق الصلب لهذه المواد الكيميائية في غطاء دخان كيميائي لمنع الاستنشاق.<ol><li>الحد الأدنى من 0.05 مل من سيلينيت الصوديوم في الماء عند 0.518 مجم / مل ، 0.5 مل من البوتريسين في الماء عند 160 مجم / مل ، 0.165 مل من البروجسترون في 100٪ إيثانول عند 0.6 مجم / مل (انظر جدول المواد).</li>
			<li>قم بتخزين الحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عامين.</li>
		</ol></li>
		<li>في خزانة السلامة الأحيائية (BSC)، يضاف ما يلي إلى 58.035 مل من DMEM-F12.<ol><li>0.05 مل من محلول سيلينيت الصوديوم 0.518 ملغم / مل ، 0.5 مل من محلول بوتريسين 160 مجم / مل ، 0.165 مل من محلول البروجسترون 0.6 مجم / مل.</li>
			<li>مرشح تعقيم الخليط أعلاه مع مرشح 0.22 ميكرومتر.</li>
		</ol></li>
		<li>لا يزال في BSC ، وإعداد محلول 100 ملغ / مل من أبوترانسفيرين.<ol><li>أضف 5 مل من DMEM-F12 إلى 500 ملغ من أبورترانفيرين (انظر جدول المواد). أعد تعليق الحاوية وغسلها ببطء ، وتجنب الفقاعات.</li>
			<li>بعد تعليق وإزالة أكبر قدر ممكن باستخدام 5 مل ، أضفه إلى محلول السيلينيت / البوتريسين / البروجسترون. خذ المزيد من المحلول السابق واغسل زجاجة apotransferrin ، وأخرج أكبر قدر ممكن منها.</li>
		</ol></li>
		<li>أضف 5 مل من 7.5٪ جزء BSA V (انظر جدول المواد) إلى المحلول.</li>
		<li>مزيج و aliquot 6.875 مل لكل أنبوب. تخزين القسمة في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.</li>
		<li>عند استخدام حصص N2 المذكورة أعلاه لصنع وسائط N2B27 ، قم بإذابة القسمة المطلوبة وأضف 3.125 مل من محلول الأنسولين 4 مجم / مل (انظر جدول المواد) إلى 6.875 N2 مقابل 10 مل من 100x N2.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد الوسائط القاعدية N2B27.<ol><li>قم بإذابة مكملات N2 و B27 في ثلاجة 4 درجات مئوية لبضع ساعات أو طوال الليل.</li>
		<li>في BSC ، امزج 484.5 مل من DMEM-F12 و 484.5 مل من الوسائط العصبية القاعدية (انظر جدول المواد) في زجاجة معقمة سعة 1 لتر.</li>
		<li>أضف 10 مل من B27 و 10 مل من مكمل N2 إلى الوسائط.</li>
		<li>أضف 1 مل من 55 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول (انظر جدول المواد). أضف 10 مل من 100x جلوتاماكس. تخلط بقوة عن طريق تحريك الزجاجة.</li>
		<li>قسمة الحجم المطلوب لكل قسمة (عادة 100 مل) وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. يحفظ في الاستخدام بعد الذوبان على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد وسائط NBiL.<ol><li>قم بإذابة 100 مل من الوسط القاعدي N2B27 من -80 درجة مئوية في الثلاجة 4 درجة مئوية.</li>
		<li>في BSC ، أضف LIF (انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / لتر.</li>
		<li>أضف CHIR99021 (3 ميكرومتر نهائي) و PD0325901 (1 ميكرومتر نهائي) (انظر جدول المواد). تخلط جيدا مع ماصة مصلية 50 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.</li>
	</ol></li>
	<li>تحضير 0.2 ٪ محلول الجيلاتين.<ol><li>انقل 500 مل من H2O المقطر المزدوج إلى زجاجة زجاجية سعة 1 لتر.</li>
		<li>قم بقياس 1 غرام من الجيلاتين (انظر جدول المواد) وأضفه إلى الماء. تخلط عن طريق هز الزجاجة حتى تذوب في الغالب.</li>
		<li>الأوتوكلاف الجيلاتين وخليط الماء عند 15 رطل / بوصة مربعة ، 121 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة. بمجرد تبريده ، قم بتعقيمه بمرشح 0.22 ميكرومتر في BSC. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.</li>
	</ol></li>
	<li>تحضير وسائط الغسيل.<ol><li>في BSC ، امزج 160 ميكرولتر من 7.5٪ BSA لكل 10 مل من DMEM-F12.</li>
		<li>قم بقياس ما سبق واستعد بكميات كبيرة لسهولة الاستخدام المستقبلي (على سبيل المثال 8 مل من 7.5٪ BSA إلى 500 مل من DMEM-F12). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.</li>
	</ol></li>
</ol>2. إعداد الكواشف لنقل متعدد mPSC
ملاحظة: يتم توفير القيم التالية لبئر واحد من لوحة 24 بئر. يمكن قياس القيم وفقا لذلك. يتم تفصيل تسلسل جميع الحمض النووي / البلازميدات في الملف التكميلي 1.
<ol><li>احسب حجم محلول الحمض النووي اللازم لكل علاج.<ol><li>تحضير 500 نانوغرام من الحمض النووي لكل بئر / حالة.<ol><li>في حالة نقل بلازميد واحد بمحلول DNA يبلغ 100 نانوغرام / ميكرولتر ، قم بإعداد أنبوب واحد يحتوي على 5 ميكرولتر من الحمض النووي.</li>
			<li>في حالة نقل اثنين من البلازميدات عند 100 نانوغرام / ميكرولتر لكل منهما ، قم بإعداد أنبوبين مع 2.5 ميكرولتر في كل منهما ، واحد لكل بلازميد.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>في BSC ، قم بإجراء ما يلي: لكل معالجة نقل 500 نانوغرام (انظر جدول المواد) ، قسمة 25 ميكرولتر من OptiMEM في أنبوب 1.5 مل.<ol><li>قم بقياس هذا وفقا لذلك - على سبيل المثال أعلاه ، قم بإعداد أنبوبين ، يحتوي كل منهما على 250 نانوغرام من الحمض النووي (2.5 ميكرولتر) و 12.5 ميكرولتر من OptiMEM.</li>
	</ol></li>
	<li>أضف الحجم المطلوب من الحمض النووي لهذا العلاج إلى OptiMEM في الأنبوب.</li>
	<li>لكل أنبوب يحتوي على 500 نانوغرام من الحمض النووي و OptiMEM ، قم بإنشاء أنبوب مطابق مع 25 ميكرولتر أخرى من OptiMEM و 1 ميكرولتر من كاشف النقل القائم على الدهون الموجبة .<ol><li>مرة أخرى ، يجب قياس هذه القيم وفقا لذلك. على سبيل المثال أعلاه ، قم بإعداد أنبوبين ، يحتوي كل منهما على 12.5 ميكرولتر من OptiMEM و 0.5 ميكرولتر من كاشف النقل. ملاحظة: عند قياس القيم ، استخدم كتلة الحمض النووي المضافة ، وليس الحجم المطلوب لتلك الكمية من الحمض النووي. يمكن قياس التفاعلات مع كاشف النقل والحمض النووي (على سبيل المثال ، إذا كان سيتم نقل 5 آبار بنفس الحمض النووي). حافظ على نسب الكواشف كما هي ، ولكن قم بالقياس وفقا لذلك (على سبيل المثال ، 1000 نانوغرام من الحمض النووي: 50 ميكرولتر OptiMEM: كاشف نقل 2 ميكرولتر: 50 ميكرولتر OptiMEM).</li>
	</ol></li>
</ol>3. إعداد mPSCs للنقل
ملاحظة: للنقل العكسي ، قم بإعداد وعاء الاستزراع وتمرير mPSCs مباشرة قبل إضافة كواشف النقل. للانتقال الأمامي ، قم بالمرور واللوحة الخلايا قبل 12-18 ساعة من النقل للسماح للخلايا بالالتصاق باللوحة.
<ol><li>تحضير وعاء زراعة الخلايا المغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.2٪.<ol><li>خطط لعدد الآبار اللازمة للنقل (بئر واحد من صفيحة 24 بئرا لكل معالجة / مجموعة).</li>
		<li>أضف 200 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.2٪ إلى كل بئر من الآبار المرغوبة في لوحة 24 بئرا.</li>
		<li>هز اللوحة برفق لنشر المحلول بالتساوي ، مع التأكد من أنه يغطي قاع البئر بالكامل.</li>
		<li>اترك الآبار مغطاة لمدة لا تقل عن 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>باستخدام شفاط فراغ ، قم بإزالة أي جيلاتين متبقي بعناية من الآبار (قم بإمالة اللوحة لضمان إزالة كل السوائل دون كشط طبقة الجيلاتين).</li>
		<li>أضف 0.5 مل من وسائط NBiL (الخطوة 1.3) إلى كل بئر واترك اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة للتدفئة المسبقة.</li>
	</ol></li>
	<li>مرور mPSCs.<ol><li>القسمة 30 مل من وسائط الغسيل (الخطوة 1.5) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.</li>
		<li>نضح الوسائط القديمة من طبق زراعة الأنسجة من mESCs. ملاحظة: العديد من تقنيات الشفط مسموح بها. مهما كانت التقنية التي يتم اختيارها ، تأكد من أن الخلايا لا تبقى جافة لفترات طويلة (حوالي 30 ثانية كحد أقصى).</li>
		<li>أضف الكمية المطلوبة من وسط فصل الخلايا المتاح تجاريا (1.5 مل لطبق 10 سم ، وقم بالمقياس وفقا لذلك ، انظر جدول المواد).</li>
		<li>انتظر لمدة 3-5 دقائق قبل السحب لأعلى ولأسفل 15-20 مرة باستخدام ماصة P1000 للحصول على تعليق أحادي الخلية. عرض الخلايا تحت المجهر لضمان تعليق خلية واحدة.</li>
		<li>انقل الخلايا الموجودة في وسط الانفصال إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على وسائط غسيل.</li>
		<li>أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح وسائط الغسيل ، مما يضمن عدم بقاء سائل متبقي في الأنبوب.</li>
		<li>أعد تعليق الحبيبات في حجم صغير من وسائط الغسيل (~ 300 ميكرولتر). عد معلق الخلية باستخدام مقياس الدم للحصول على كثافة الخلية.</li>
	</ol></li>
</ol>4. النقل العكسي ل mPSCs
<ol><li>تحضير كواشف النقل المتعدد وفقا للخطوة 2.</li>
	<li>قم بإعداد وعاء زراعة الخلايا وتمرير mPSCs وفقا للخطوة 3.</li>
	<li>Aliquot 200 ميكرولتر من وسائط NBiL إلى أنابيب 1.5 مل ، واحد لكل علاج.</li>
	<li>أضف 26 ميكرولتر من OptiMEM: خليط كاشف النقل إلى خليط الحمض النووي: OptiMEM. امزج الكواشف بسرعة وقوة عن طريق سحب الكواشف حوالي 10 مرات. اترك الخليط يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>بناء على كثافة الخلية ، انقل الحجم المطلوب من الخلايا من معلق الخلية 300 ميكرولتر إلى أنابيب NBiL سعة 200 ميكرولتر للحصول على 25000 خلية لكل أنبوب.</li>
	<li>بعد 5 دقائق من حضانة ليبوفيكتامين 2000 (L2K ، كاشف النقل) وخليط الحمض النووي ، أضفه إلى أنبوب الخلايا سعة 1.5 مل واخلطه جيدا عن طريق الماصة. اسمح للخلايا بالاحتضان باستخدام الكاشف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ماصة خارج السائل ، وترك حوالي 50 ميكرولتر.</li>
	<li>أعد تعليق حبيبات الخلية ب 100 ميكرولتر من وسائط NBiL. نقل الخلايا إلى لوحة ووضع لوحة في الحاضنة. قم بتغيير الوسائط بعد 24 ساعة باستخدام وسائط NBiL جديدة.</li>
</ol>5. النقل الأمامي ل mPSCs
<ol><li>12-18 ساعة قبل النقل ، قم بإعداد وعاء زراعة الخلايا وممر mPSCs وفقا للخطوة 3.</li>
	<li>بناء على كثافة الخلية ، انقل الحجم المطلوب من الخلايا من خليط الخلايا 300 ميكرولتر إلى 25000 خلية لكل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة.</li>
	<li>1 ساعة قبل النقل ، قم بشفط الوسائط من جميع الآبار واستبدلها ب 0.5 مل من وسائط NBiL. ضع اللوحة في الحاضنة.</li>
	<li>في وقت النقل ، قم بإعداد كواشف mPSC poly-transfection وفقا للخطوة 2.</li>
	<li>أضف 26 ميكرولتر من OptiMEM: خليط كاشف النقل إلى خليط الحمض النووي: OptiMEM. امزج الكواشف بسرعة وقوة عن طريق سحب الكواشف حوالي 10 مرات. اترك الخليط المركب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>أضف الخليط المركب إلى الآبار بالتنقيط. ضع اللوحة في الحاضنة. قم بتغيير الوسائط بعد 24 ساعة.</li>
</ol>6. قياس التدفق الخلوي
<ol><li>نضح الوسائط من لوحة 24 بئرا المنقولة بعد 48 ساعة من النقل.</li>
	<li>أضف 200 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر ، ودوامة ، واحتضان لمدة 30 ثانية عند 37 درجة مئوية. اضغط على جوانب اللوحة وأضف 200 ميكرولتر من مخزن FACS المؤقت المثلج (2٪ FBS في PBS).</li>
	<li>افتح وملصق لوحة 96 بئر ذات قاع V ، بدءا من A1. امزج محتويات كل بئر على اللوحة المنقولة لإزاحة الخلايا وصنع محاليل أحادية الخلية باستخدام ماصة P200. انقل 200 ميكرولتر من كل بئر إلى البئر المناسب على لوحة 96 بئرا.</li>
	<li>أضف 15 مل من المخزن المؤقت FACS إلى خزان كاشف سعة 50 مل. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة المكونة من 96 بئرا في الحوض بحركة سريعة وسلسة.</li>
	<li>استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق الكريات على لوحة 96 بئرا في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS من خزان الكاشف. كرر الخطوات 6.4-6.5 مرتين. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في صندوق مملوء بالثلج محمي من الضوء.</li>
	<li>قم بتشغيل العينات من خلال مقياس التدفق الخلوي للحصول على توزيعات السكان لمراسلي الفلورسنت.<ol><li>تأكد من أن مقياس الخلايا مناسب من حيث مجموعات الليزر والمرشحات للتجربة التي سيتم إجراؤها (على سبيل المثال ، لا تستخدم مراسل الأشعة تحت الحمراء إذا لم يكن من الممكن الإثارة أو الكشف في الطيف الأحمر البعيد).</li>
		<li>قم بتضمين عينات إضافية لخرز التقييس للسماح بتحويل MEFL للبيانات أثناء التحليل. التأكد من جمع خلايا كافية لكل عينة للتحليل الإحصائي المناسب9.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتحويل وحدات الفلورسنت من ملفات مقياس الخلايا الخام وتحليل البيانات باستخدام أي من الطرق العديدة ، مثل خطوط الأنابيب المستندة إلى Python أو MATLAB أو البرامج المتاحة تجاريا 9,13.</li>
</ol>

تحليل مقارن لطرق النقل الأمامي والعكسي على mPSCs

<ol>
	<li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design:+Engineering+the+mammalian+cell.">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li><li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro.">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li><li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Tamm, C., Galit&#243;, S. P., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing.">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156 (2013).</li><li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+pluripotency:+in+vitro+adaptations+of+a+continuum+of+in+vivo+states.">The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states.</a> BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).</li><li>Mulas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+propagation+and+manipulation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells.</a> Development. 146 (6), 173146 (2019).</li><li>Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galit&#243;, S., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+efficient+transfection+of+mouse+embryonic+stem+cells+using+non-viral+reagents.">Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).</li><li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165 (2021).</li><li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;poly-transfection&amp;#34;+method+for+rapid,+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems.">A &amp;#34;poly-transfection&amp;#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).</li><li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells.">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).</li><li>Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+cell+state+identification+circuits+with+poly-transfection.">Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (192), e64793 (2023).</li><li>Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics.">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li><li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoflow:+A+python+toolbox+for+flow+cytometry.">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter.">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611 (2010).</li></ol>

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

ومن الأسباب الرئيسية لاعتماد بروتوكولات النقل على نطاق واسع إمكانية استنساخها وإمكانية الوصول إليها؛ ومع ذلك ، تتطلب هذه البروتوكولات التحسين عبر السياقات التجريبية. لم يذكر أعلاه هو الاختبار القياسي المطلوب عند محاولة نقل خط خلية جديد لأول مرة. أولا ، يعد اختيار كاشف النقل أمرا أساسيا ?...

يعد توصيل الحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى خلايا الثدييات بمثابة ركيزة أساسية للبحوث الطبية الحيوية1. طريقة شائعة لإدخال الأحماض النووية الخارجية (NA) في خلايا الثدييات هي من خلال النقل العابر 2,3. تعتمد هذه التقنية على خلط NA مع كواشف النقل المتاحة تجاريا القادرة على توصيلها إلى الخلايا المتلقية. عادة ، يتم تسليم NA عن طريق النقل الأمامي ، حيث تتلقى الخلايا الملتصقة بسطح ثنائي الأبعاد مجمع النقل. في حين أن النقل الأمامي لخطوط الخلايا الراسخة الأكثر شيوعا قوي والبروتوكولات منشورة جيدا ، فإن أنواع الخلايا الأكثر تخصصا ذات الأشكال غير أحادية الطبقة لا تنتقل بسهولة ، مما يحد من كمية NA التي يمكن تسليمها وعدد الخلايا التي تستقبلها.
تعمل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) كنموذج جذاب لفهم التطور وكأداة للطب التجديدي ، نظرا لقدرتها على الانقسام إلى أجل غير مسمى وإنتاج أي نوع من خلايا الجسم. بالنسبة ل PSCs للفأر (mPSCs) ، تحافظ ظروف الزراعة الروتينية في المختبر مع مثبطين و LIF (2i / LIF) على مورفولوجيا مستعمرة تشبه القبة ، مما يحد بشكل مباشر من عدد الخلايا المعرضة للانتقال الأمامي4،5،6. لمعالجة هذا ، يمكن إجراء نقل عكسي: تضاف الخلايا إلى طبق يحتوي على وسائط وكاشف نقل ، بدلا من إضافة كاشف نقل إلى الخلايا الملتصقة7. في حين أن هذا يزيد من عدد الخلايا المعرضة للكاشف ، فإنه يتطلب أيضا مرور الخلايا ونقلها بشكل متزامن.
بالانتقال إلى ما هو أبعد من عمليات نقل NA المفردة البسيطة ، غالبا ما يهدف الباحثون إلى توصيل العديد من تركيبات NA إلى مجموعة من الخلايا في المختبر. يتم تحقيق ذلك عادة من خلال النقل المشترك ، حيث يتم خلط NAs بنسبة معينة (1: 1 ، 9: 1 ، إلخ) ثم يتم دمجها مع كاشف النقل المختار8. ينتج عن هذا مزيج من NAs والكاشف الذي يحافظ على النسبة الأصلية من NAs إلى بعضها البعض - في حين أن الخلايا في العلاج قد تتلقى كميات مختلفة من هذا المزيج ، فإنها تتلقى جميعها نفس النسبة9. في حين أن هذا مفيد عندما تكون النسبة المطلوبة للأجزاء معروفة ، فإن تحديد هذه النسبة في وقت مبكر يمكن أن يكون كثيف العمالة ، حيث تشكل كل نسبة حالة مختلفة. أحد البدائل هو إجراء "نقل متعدد" ، حيث يتم خلط NAs الفردية مع كاشف النقل بشكل مستقل عن بعضها البعض9. من خلال الجمع بين مجمعات النقل التي تحتوي على NAs الفردية (بدلا من الجمع بين NAs قبل إنشاء المجمعات) ، يمكن للباحثين استكشاف مجموعة واسعة من مقاييس NA المتكافئة في تجربة نقل واحدة9. هذا مهم بشكل خاص في الحالات التي يتوقع فيها أن تتفاعل منتجات العديد من NAs مع بعضها البعض ، مثل أنظمة النسخ المستحثة أو الأنظمة ذات التعليقات المضمنة في1،10،11. ومع ذلك ، للقيام بذلك بشكل فعال ، هناك حاجة إلى كفاءة نقل عالية. في الواقع ، مع زيادة عدد NAs الفريدة المنقولة ، فإن احتمال تلقي خلية معينة لجميع NAs المطلوبة يتناقص أضعافا مضاعفة 9,12.
يصف التقرير التالي بروتوكول النقل العكسي ل mPSCs باستخدام كاشف نقل قائم على الدهون الكاتيونية ، حيث تتعرض الخلايا لمزيج الكاشف - NA لمدة أقصاها 5 دقائق لزيادة الجدوى وتقليل الوقت خارج ظروف الاستزراع النموذجية. توضح مقارنة هذا البروتوكول بالنقل الأمامي القياسي لهذه الخلايا كفاءة نقل أعلى وزيادة في العدد الإجمالي للخلايا المنقولة الباقية. من خلال الجمع بين هذا النقل العكسي مع ثلاثة بلازميد متعدد النقل الذي يتضمن مراسلين فلورسنت بسيطين ، يتم إثبات إمكانية موسعة لفحص نسب NA بكفاءة نقل عالية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apotransferrin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T1147-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction V (7.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SML1046-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D6421-24X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry standardization beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URCP-38-2K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>PZ0162-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6780</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mLIF&#160;</td>
			<td>BioTechne</td>
			<td>8878-LF-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S5261-25G</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized mouse embryonic stem cell based reverse poly-transfection technique for rapid exploration of nucleic acid ratios

نظرا لبساطته النسبية وسهولة استخدامه ، أصبح النقل العابر لخطوط خلايا الثدييات بالأحماض النووية دعامة أساسية في البحوث الطبية الحيوية. في حين أن معظم خطوط الخلايا المستخدمة على نطاق واسع لديها بروتوكولات قوية للانتقال في ثقافة ثنائية الأبعاد ملتصقة ، فإن هذه البروتوكولات غالبا لا تترجم جيدا إلى خطوط أقل دراسة أو تلك التي تحتوي على أشكال غير نمطية يصعب نقلها. باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات للفأر المزروعة في وسائط 2i / LIF ، وهو نموذج استزراع يستخدم على نطاق واسع للطب التجديدي ، تحدد هذه الطريقة بروتوكول نقل عكسي محسن وسريع قادر على تحقيق كفاءة نقل أعلى. بالاستفادة من هذا البروتوكول ، يتم إجراء نقل متعدد ثلاثي البلازميد ، مع الاستفادة من الكفاءة الأعلى من المعتاد في توصيل البلازميد لدراسة نطاق موسع من القياس الكيميائي للبلازميد. يسمح بروتوكول النقل المتعدد العكسي هذا بطريقة تجريبية ذات وعاء واحد ، مما يمكن المستخدمين من تحسين نسب البلازميد في بئر واحد ، بدلا من العديد من عمليات النقل المشتركة. من خلال تسهيل الاستكشاف السريع لتأثير القياس الكيميائي للحمض النووي على الوظيفة العامة للدوائر الجينية المسلمة ، يقلل هذا البروتوكول من وقت وتكلفة نقل الخلايا الجذعية الجنينية.

Delivery of DNA and RNA into mammalian cells serves as a core pillar of biomedical research1. A common method for introducing exogenous nucleic acids (NA) into mammalian cells is through transient transfection2,3. This technique relies on mixing NA with commercially available transfection reagents capable of delivering them into the recipient cells. Typically, NA is delivered via forward transfection, where cells adhering to a two-dimensional surface receive the transfection complex. While forward transfection for the most common established cell lines is robust and protocols are well-published, more niche cell types with non-monolayer morphologies do not transfect easily, limiting the amount of NA that can be delivered and the number of cells that receive it.
Pluripotent stem cells (PSCs) serve as an attractive model for understanding development and as a tool for regenerative medicine, given their ability to divide indefinitely and produce any bodily cell type. For mouse PSCs (mPSCs), routine in vitro culture conditions with 2 inhibitors and LIF&#160;(2i/LIF) maintain a dome-like colony morphology, directly limiting the number of cells exposed to a forward transfection4,5,6. To address this, a reverse transfection can be performed: cells are added to a dish containing media and transfection reagent, rather than adding transfection reagent to adherent cells7. While this increases the number of cells exposed to the reagent, it also requires the cells to be passaged and transfected concurrently.
Moving beyond simple single-NA transfections, researchers often aim to deliver several NA constructs into a population of cells in vitro. This is typically achieved through a co-transfection, where the NAs are mixed at a given ratio (1:1, 9:1, etc.) and are then combined with the chosen transfection reagent8. This yields a mix of NAs and reagent that preserves the original ratio of NAs to one another - while cells in the treatment may receive different amounts of this mix, they all receive the same ratio9. While this is advantageous when the desired ratio of parts is known, determining this ratio ahead of time can be labor-intensive, with each ratio constituting a different condition. One alternative is to perform a &#34;poly-transfection,&#34; where individual NAs are mixed with the transfection reagent independently from one another9. By combining transfection complexes containing individual NAs (rather than combining NAs before creating the complexes), researchers can explore a wide array of NA stoichiometries in a single transfection experiment9. This is particularly valuable in cases where the products of several NAs are expected to interact with one another, such as with inducible transcription systems or systems with feedback built in1,10,11. However, to do so effectively, a high transfection efficiency is needed. Indeed, as the number of unique transfected NAs increases, the probability of a given cell receiving all of the desired NAs decreases exponentially9, 12.
The following report describes a reverse transfection protocol for mPSCs using a cationic lipid-based transfection reagent, in which cells are exposed to the reagent-NA mix for a maximum of 5 min to maximize viability and minimize the time outside of typical culture conditions. Comparing this protocol to the standard forward transfection of these cells demonstrates a higher transfection efficiency and an increase in the total number of surviving transfected cells. By combining this reverse transfection with a three-plasmid poly-transfection involving simple fluorescent reporters, an expanded potential to screen NA ratios with high transfection efficiency is demonstrated.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في الأجهزة الوراثية الاصطناعية لمعالجة مصير الخلايا الجذعية وتطوير العلاج الخلوي

تقنية نقل عكسي عكسية قائمة على الخلايا الجذعية الجنينية للفأر للاستكشاف السريع لنسب الحمض النووي

Our work generally focuses on using synthetic genetic devices to manipulate stem cell fate and behavior. By controlling cellular states, we aim to advance the development of next generation cellular therapies. Recently, a deeper understanding of the relationship between the dosage of a fate determining gene and the cell's lineage has been established.This was facilitated by the development of genetic controllers that are able to titrate a given gene precisely. Classic molecular biology techniques such as transfection or lentiviral transduction for simple gene over expression will always be a mainstay. However, our field has recently adopted synthetic devices that incorporate linear and non-linear feedback in order to obtain more complex outputs from delivered DNA.Gene dosage has a key role in determining the outcome of gene expression. When delivering multiple exogenous genes, a key experimental factor is how much of each gene will give the optimal or desired outcome. Our protocol allows researchers to rapidly scan across dosages in a single treatment, looking for the desired ratio of DNA devices.

تعتمد كل من عمليات النقل الأمامية والعكسية على التفاعل بين غشاء الخلية ومجمعات كاشف الحمض النووي الوارد ، مما يسمح بتوصيل NA إلى الخلايا المستقبلة. حيث تختلف هذه التقنيات هي حالة الخلية عند الولادة - بينما يتم تسليم الحمض النووي عادة إلى أحاديات الخلايا الملتصقة في النقل الأمامي التقليدي ?...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول طريقة للنقل العكسي المتعدد للخلايا الجذعية الجنينية للفأر أثناء الزراعة باستخدام وسائط 2i و LIF. تنتج هذه الطريقة قابلية وكفاءة أعلى من بروتوكولات النقل الأمامية التقليدية ، مع تمكين تحسين نسب البلازميد في وعاء واحد.

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

يركز عملنا بشكل عام على استخدام الأجهزة الوراثية الاصطناعية للتلاعب بمصير الخلايا الجذعية وسلوكها. من خلال التحكم في الحالات الخلوية ، نهدف إلى تعزيز تطوير الجيل التالي من العلاجات الخلوية. في الآونة الأخيرة ، تم تأسيس فهم أعمق للعلاقة بين جرعة الجين الذي يحدد المصير ونسب الخلية.تم تسهيل ذلك من خلال تطوير وحدات تحكم وراثية قادرة على معايرة جين معين بدقة. تقنيات البيولوجيا الجزيئية الكلاسيكية مثل النقل أو نقل lentiviral للجين البسيط على التعبير ستكون دائما الدعامة الأساسية. ومع ذلك ، فقد اعتمد مجالنا مؤخرا الأجهزة الاصطناعية التي تتضمن ردود فعل خطية وغير خطية من أجل الحصول على مخرجات أكثر تعقيدا من الحمض النووي المسلم.تلعب جرعة الجينات دورا رئيسيا في تحديد نتيجة التعبير الجيني. عند توصيل جينات خارجية متعددة ، فإن العامل التجريبي الرئيسي هو مقدار كل جين الذي سيعطي النتيجة المثلى أو المرجوة. يسمح بروتوكولنا للباحثين بالمسح السريع عبر الجرعات في علاج واحد ، بحثا عن النسبة المطلوبة من أجهزة الحمض النووي.

an-optimized-mouse-embryonic-stem-cell-based-reverse-poly

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

692 Views.  University of British Columbia. يركز عملنا بشكل عام على استخدام الأجهزة الوراثية الاصطناعية للتلاعب بمصير الخلايا الجذعية وسلوكها. من خلال التحكم في الحالات الخلوية ، نهدف إلى تعزيز تطوير الجيل التالي من العلاجات الخلوية. في الآونة الأخيرة ، تم تأسيس فهم أعمق للعلاقة بين جرعة الجين الذي يحدد المصير ونسب...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في الأجهزة الوراثية الاصطناعية لمعالجة مصير الخلايا الجذعية وتطوير العلاج الخلوي

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical research. While most widely used cell lines have robust protocols for transfection in adherent two-dimensional culture, these protocols often do not translate well to less-studied lines or those with atypical, hard-to-transfect morphologies. Using mouse pluripotent stem cells grown in 2i/LIF media, a widely used culture model for regenerative medicine, this method outlines an optimized, rapid reverse transfection protocol capable of achieving higher transfection efficiency. Leveraging this protocol, a three-plasmid poly-transfection is performed, taking advantage of the higher-than-normal efficiency in plasmid delivery to study an expanded range of plasmid stoichiometry. This reverse poly-transfection protocol allows for a one-pot experimental method, enabling users to optimize plasmid ratios in a single well, rather than across several co-transfections. By facilitating the rapid exploration of the effect of DNA stoichiometry on the overall function of delivered genetic circuits, this protocol minimizes the time and cost of embryonic stem cell transfection.

The present protocol describes a method for reverse poly-transfection of mouse embryonic stem cells during culture with 2i and LIF media. This method yields higher viability and efficiency than traditional forward transfection protocols, while also enabling one-pot optimization of plasmid ratios.

Preparation of Mouse Pluripotent Stem Cells &#40;mPSCs&#41; for Transfection

To prepare a gelatin coated 24 well plate add 200 microliters of the 0.2%gelatin solution to each well. Gently shake the plate to evenly spread the solution and allow the wells to coat at room temperature. After 15 minutes, using a vacuum aspirator carefully remove any leftover gelatin from the wells.Add 0.5 milliliters of freshly prepared NBIL media to each well. And place the plate in a tissue culture incubator to prewarm. Aliquot 30 milliliters of wash media into a 50 milliliter conical tube.Aspirate the media from the tissue culture dish of mESCs and add required amount of cell detachment medium. After three to five minutes, pipette up and down 15 to 20 times using a P1, 000 pipette. Observe the cells under a microscope.To ensure a single cell suspension transfer the cell suspension into a 50 milliliter tube containing wash media. Centrifuge the suspension at 300G for five minutes at room temperature and aspirate the wash media. Resuspend the pellet in approximately 300 microliters of wash media.

تحضير الخلايا الجذعية متعددة القدرات للفأر (mPSCs) للنقل

Reverse and Forward Transfection of Mouse Pluripotent Stem Cells &#40;mPSCs&#41;

To begin, aliquot 200 microliters of NBIL media into 1.5 milliliter tubes. Add 26 microliters of the optimum transfection reagent mixture to the DNA optimum mixture. Pipe at the reagents vigorously approximately 10 times.Transfer the required volume of mPSC suspensions to the 200 microliters of NBIL tubes. Then add lipofectamine 2000 and DNA mixture to the tubes and mix well by pipetting. After five minutes, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes and remove the supernatant, leaving approximately 50 microliters in the tube.Re suspend the pellet in 100 microliters of NBIL media. Transfer the cell suspension to a gelatin-coated 24-well plate and place plate in the incubator. Transfer the required volume of mPSC suspension to seed 25, 000 cells per well of a gelatin coated 24-well plate and place the plate in the incubator.One hour prior to transfection. Replace the media from the wells with 0.5 milliliters of NBIL media. After incubation, dropwise, add lipofectamine 2000 and DNA mixture to the wells.Place the plate in the incubator for 48 hours.

النقل العكسي والأمامي للخلايا الجذعية متعددة القدرات للفأر (mPSCs)

Flow Cytometry Analysis of Transfected Mouse Pluripotent Stem Cells &#40;mPSCs&#41;

After transfection of mPSCs, aspirate the media from the six-well plate. Then add 200 microliters of trypsin into each well. Swirl and incubate for 30 seconds at 37 degrees Celsius.Tap the side of the plate and add 200 microliters of ice cold FACS buffer. Using a P200 pipette, mix the contents of each well to dislodge cells and make single cell solutions. Transfer 200 microliters from each well to the appropriate well on the 96-well plate Centrifuge the plate at 300 G for five minutes.After centrifugation, resuspend the pellets in 150 microliters of FACS buffer before running the sample on a flow cytometer. Compared to reverse transfections, forward transections showed a significantly lower proportion of cells positive for the marker. Interestingly, forward Transfect did not deliver a significantly lower amount of DNA on average to the population of cells.In reverse transections, incubation time significantly influenced the percentage of reporter positive cells. However, the average reporter expression in positive cells was not affected by incubation time. For both poly and co-transfection, a forward transfection significantly decreased the number of cells present at the chosen endpoint compared to reverse transfections.In the case of reverse poly-transections, higher transfection efficiency and a broader dynamic range of well-represented DNA ratios were observed.