Yazarlar, alan sınırlamaları nedeniyle bu çalışmada atıfta bulunulmayan alana yapılan birçok katkının yanı sıra bu fırsatı sağlayan finansman kuruluşlarına da teşekkür etmek istemektedir. Yazarlar, bu çalışmayı destekleyen Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden (CIHR) fon aldığını kabul etmektedir. K.M., NSERC'den CGS-M bursu ve British Columbia Üniversitesi'nden Killam Doktora Bursu almıştır. N.S., Michael Smith Health Research BC Scholar Ödülü'nün sahibidir.

1. mPSC kültürü için reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>N2 takviyesi hazırlayın.<ol><li>Steril olmayan koşullarda, bir kimyasal güvenlik çeker ocakta aşağıdaki stok çözeltilerini (adım 1.1.1.1) hazırlayın. Her kimyasalın katı tozunu önceden tartılmış 50 mL'lik bir konik tüpe ekleyin. Tozu ekledikten sonra her bir tüpü tartın ve aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda çözücü ekleyin. Bir parti medya için, listelenen minimum miktarı hazırlayın. NOT: Aşağıdaki reaktifler tehlikelidir ve yerel kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak kullanılmalıdır. Kullanım sırasında uygun KKD'yi sağlayın ve solunmasını önlemek için yalnızca bu kimyasalların katı toz formlarıyla kimyasal çeker ocakta çalışın.<ol><li>0.518 mg / mL'de suda minimum 0.05 mL sodyum selenit, 160 mg / mL'de suda 0.5 mL putresin, 0.6 mg / mL'de% 100 etanolde 0.165 mL progesteron (bkz.</li>
			<li>Solüsyonları -20 °C'de 2 yıla kadar saklayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Bir biyogüvenlik kabininde (BSC), 58.035 mL DMEM-F12'ye aşağıdakileri ekleyin.<ol><li>0.05 mL 0.518 mg / mL sodyum selenit çözeltisi, 0.5 mL 160 mg / mL putresin çözeltisi, 0.165 mL 0.6 mg / mL progesteron çözeltisi.</li>
			<li>Filtre, yukarıdaki karışımı 0.22 μm'lik bir filtre ile sterilize eder.</li>
		</ol></li>
		<li>Hala BSC'de, 100 mg / mL'lik bir apotransferrin çözeltisi hazırlayın.<ol><li>500 mg apotransferrine 5 mL DMEM-F12 ekleyin (bkz. Kabarcıklardan kaçınarak kabı yavaşça yeniden askıya alın ve yıkayın.</li>
			<li>5 mL ile mümkün olduğunca yeniden süspanse ettikten ve çıkardıktan sonra, selenit / putresin / progesteron çözeltisine ekleyin. Önceki solüsyondan daha fazlasını alın ve apotransferrin şişesini yıkayın, mümkün olduğunca fazlasını çıkarın.</li>
		</ol></li>
		<li>Çözeltiye 5 mL %7.5 BSA fraksiyonu V ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Tüp başına 6.875 mL'yi karıştırın ve alikotlayın. Alikotları -80 °C'de 1 yıla kadar saklayın.</li>
		<li>N2B27 ortamı yapmak için yukarıdaki N2 alikotlarını kullanırken, istenen alikotu çözün ve 10 mL 100x N2 için 6.875 N2'ye 3.125 mL 4 mg / mL insülin çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>N2B27 bazal ortamını hazırlayın.<ol><li>N2 ve B27 takviyelerini 4 °C'lik bir buzdolabında birkaç saat veya gece boyunca çözdürün.</li>
		<li>Bir BSC'de, steril 1 L'lik bir şişede 484.5 mL DMEM-F12 ve 484.5 mL Nörobazal ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız) karıştırın.</li>
		<li>Ortama 10 mL B27 ve 10 mL N2 takviyesi ekleyin.</li>
		<li>1 mL 55 mM beta-merkaptoetanol ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). 10 mL 100x glutamax ekleyin. Şişeyi döndürerek kuvvetlice karıştırın.</li>
		<li>Alikot başına istenen hacmi (tipik olarak 100 mL) ayırın ve -80 ° C'de 1 yıla kadar saklayın. 4 °C'de çözdürüldükten sonra 3 haftaya kadar kullanımda saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>NBiL ortamını hazırlayın.<ol><li>100 ° C'lik buzdolabında -80 ° C'den 27 mL'lik bir N4B4 bazal ortam alikotunu çözdürün.</li>
		<li>Bir BSC'de, 10 μg/L'lik bir nihai konsantrasyona LIF ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
		<li>CHIR99021 (3 μM final) ve PD0325901 (1 μM final) ekleyin (bkz. 50 mL'lik bir serolojik pipetle iyice karıştırın. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>% 0.2 jelatin çözeltisi hazırlayın.<ol><li>500 mL çift damıtılmışH2O'yu1 L'lik bir cam şişeye aktarın.</li>
		<li>1 g jelatin ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve suya ekleyin. Çoğunlukla eriyene kadar şişeyi sallayarak karıştırın.</li>
		<li>Jelatin ve su karışımını 15 psi, 121 °C'de 35 dakika otoklavlayın. Soğuduktan sonra, filtre bir BSC'de 0,22 μm'lik bir filtre ile sterilize edin. 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yıkama ortamı hazırlayın.<ol><li>Bir BSC'de, 10 mL DMEM-F12 başına 160 μL %7.5 BSA karıştırın.</li>
		<li>Yukarıdakileri ölçeklendirin ve ileride kullanım kolaylığı için büyük miktarlarda hazırlayın (örneğin, 8 mL %7,5 BSA ila 500 mL DMEM-F12). 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. mPSC poli-transfeksiyonu için reaktiflerin hazırlanması
NOT: Aşağıdaki değerler, 24 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğu için sağlanmıştır. Değerler buna göre ölçeklendirilebilir. Tüm DNA/plazmitlerin dizileri Ek Dosya 1'de detaylandırılmıştır.
<ol><li>Tedavi başına gereken DNA çözeltisinin hacmini hesaplayın.<ol><li>Kuyu / koşul başına 500 ng DNA hazırlayın.<ol><li>Tek bir plazmiti 100 ng/μL'lik bir DNA çözeltisi ile transfekte ediyorsanız, 5 μL DNA içeren bir tüp hazırlayın.</li>
			<li>Her biri 100 ng/μL'de iki plazmiti transfekte ediyorsanız, her plazmit için bir tane olmak üzere her birinde 2.5 μL olan iki tüp hazırlayın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Bir BSC'de aşağıdakileri gerçekleştirin: Her 500 ng transfeksiyon işlemi için (Malzeme Tablosuna bakınız), 25 μL OptiMEM'i 1.5 mL'lik bir tüpe ayırın.<ol><li>Bunu buna göre ölçeklendirin - yukarıdaki örnek için, her biri 250 ng DNA (2,5 μL) ve 12,5 μL OptiMEM içeren iki tüp hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bu tedavi için gerekli DNA hacmini tüpteki OptiMEM'e ekleyin.</li>
	<li>500 ng DNA ve OptiMEM'e sahip her tüp için, başka bir 25 μL OptiMEM ve 1 μL katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ile eşleşen bir tüp oluşturun.<ol><li>Yine, bu değerler buna göre ölçeklendirilmelidir. Yukarıdaki örnek için, her biri 12,5 μL OptiMEM ve 0,5 μL transfeksiyon reaktifi içeren iki tüp hazırlayın. NOT: Değerleri ölçeklendirirken, o DNA miktarı için gereken hacmi değil, eklenen DNA kütlesini kullanın. Transfeksiyon reaktifi ve DNA ile reaksiyonlar ölçeklendirilebilir (örneğin, aynı DNA ile 5 kuyu transfekte edilecekse). Reaktiflerin oranlarını aynı tutun, ancak buna göre ölçeklendirin (örneğin, 1000 ng DNA: 50 μL OptiMEM: 2 μL transfeksiyon reaktifi: 50 μL OptiMEM).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Transfeksiyon için mPSC'lerin hazırlanması
NOT: Ters transfeksiyon için, transfeksiyon reaktiflerini eklemeden önce kültür kabını hazırlayın ve mPSC'leri doğrudan geçirin. İleri transfeksiyon için, hücrelerin plakaya yapışmasını sağlamak için transfeksiyondan 12-18 saat önce hücreleri geçirin ve plakalayın.
<ol><li>% 0.2 jelatin kaplı bir hücre kültürü kabı hazırlayın.<ol><li>Transfeksiyon için gereken kuyu sayısını planlayın (tedavi/grup başına 24 oyuklu bir plakadan bir kuyu).</li>
		<li>24 oyuklu plakada istenen oyukların her birine 200 μL% 0.2 jelatin çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Çözeltiyi eşit şekilde yaymak için plakayı hafifçe sallayın ve kuyunun tüm tabanını kapladığından emin olun.</li>
		<li>Kuyucukların oda sıcaklığında en az 15 dakika kaplanmasına izin verin.</li>
		<li>Bir vakum aspiratörü kullanarak, kalan jelatini kuyulardan dikkatlice çıkarın (jelatin tabakasını kazımadan tüm sıvının çıkarılmasını sağlamak için plakayı eğin).</li>
		<li>Her bir oyuğa 0.5 mL NBiL ortamı (adım 1.3) ekleyin ve plakayı ön ısıtmak için bir doku kültürü inkübatöründe bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Geçiş mPSC'leri.<ol><li>30 mL yıkama ortamını (adım 1.5) 50 mL'lik konik bir tüpe ekleyin.</li>
		<li>Eski besiyerini mESC'lerin doku kültürü kabından aspire edin. NOT: Çeşitli aspirasyon tekniklerine izin verilir. Hangi teknik seçilirse seçilsin, hücrelerin uzun süre kuru kalmadığından emin olun (maksimum yaklaşık 30 saniye).</li>
		<li>Piyasada bulunan gerekli miktarda hücre detatchment ortamı ekleyin (10 cm'lik bir tabak için 1,5 mL, buna göre ölçeklendirin, bkz.</li>
		<li>Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için P1000 pipetle 15-20 kez yukarı ve aşağı pipetlemeden önce 3-5 dakika bekleyin. Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için hücreleri mikroskop altında görüntüleyin.</li>
		<li>Boşaltma ortamındaki hücreleri, yıkama ortamı içeren 50 mL'lik tüpe aktarın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Yıkama ortamını aspire edin, tüpte artık sıvı kalmamasını sağlayın.</li>
		<li>Peletin az miktarda yıkama ortamında (~300 μL) yeniden süspanse edilmesi. Hücre yoğunluğunu elde etmek için bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunu sayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. mPSC'lerin ters transfeksiyonu
<ol><li>Poli-transfeksiyon reaktiflerini 2. adıma göre hazırlayın.</li>
	<li>Hücre kültürü kabını ve geçiş mPSC'lerini adım 3'e göre hazırlayın.</li>
	<li>Her tedavi için bir tane olmak üzere 1.5 mL'lik tüplere 200 μL NBiL ortamı ekleyin.</li>
	<li>DNA:OptiMEM karışımına 26 μL OptiMEM:transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Reaktifleri yaklaşık 10 kez pipetleyerek hızlı ve kuvvetli bir şekilde karıştırın. Karışımın oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmesine izin verin.</li>
	<li>Hücre yoğunluğuna bağlı olarak, tüp başına 25.000 hücre elde etmek için gerekli hücre hacmini 300 μL hücre süspansiyonundan 200 μL NBiL tüplerine aktarın.</li>
	<li>Lipofectamine 2000 (L2K, transfeksiyon reaktifi) ve DNA karışımının 5 dakika inkübasyonundan sonra, 1.5 mL'lik hücre tüpüne ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Hücrelerin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca reaktifle inkübe etmesine izin verin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Sıvıyı yaklaşık 50 μL bırakarak pipetleyin.</li>
	<li>Hücre peletini 100 μL NBiL ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücreleri plakaya aktarın ve plakayı inkübatöre yerleştirin. Medyayı 24 saat sonra yeni NBiL medyası ile değiştirin.</li>
</ol>5. mPSC'lerin ileri transfeksiyonu
<ol><li>Transfeksiyondan 12-18 saat önce, hücre kültürü kabını hazırlayın ve mPSC'leri adım 3'e göre pasajlayın.</li>
	<li>Hücre yoğunluğuna bağlı olarak, 300 μL hücre karışımından gerekli hücre hacmini oyuk başına 25.000 hücreye aktarın. Plakayı inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Transfeksiyondan 1 saat önce, ortamı tüm kuyucuklardan aspire edin ve 0,5 mL NBiL ortamı ile değiştirin. Plakayı inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Transfeksiyon sırasında, mPSC poli-transfeksiyon reaktiflerini adım 2'ye göre hazırlayın.</li>
	<li>DNA:OptiMEM karışımına 26 μL OptiMEM:transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Reaktifleri yaklaşık 10 kez pipetleyerek hızlı ve kuvvetli bir şekilde karıştırın. Kombine karışımın oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmesine izin verin.</li>
	<li>Kombine karışımı damla damla kuyucuklara ekleyin. Plakayı inkübatöre yerleştirin. Medyayı 24 saat sonra değiştirin.</li>
</ol>6. Akış sitometrisi
<ol><li>Ortamı, transfeksiyondan 48 saat sonra transfekte edilmiş 24 oyuklu plakadan aspire edin.</li>
	<li>Her oyuğa 200 μL tripsin ekleyin, döndürün ve 37 ° C'de 30 saniye inkübe edin. Plakanın kenarlarına hafifçe vurun ve 200 μL buz gibi soğuk FACS tamponu (PBS'de %2 FBS) ekleyin.</li>
	<li>A96'den başlayarak V tabanlı 1 oyuklu bir plakayı açın ve etiketleyin. Hücreleri yerinden çıkarmak ve bir P200 pipeti ile tek hücreli çözeltiler yapmak için her bir oyuğun içeriğini transfekte edilmiş plaka üzerinde karıştırın. Her kuyucuktan 200 μL'yi 96 oyuklu plaka üzerindeki uygun kuyuya aktarın.</li>
	<li>50 mL'lik bir reaktif rezervuarına 15 mL FACS tamponu ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. 96 oyuklu plakayı hızlı ve yumuşak bir hareketle lavaboya ters çevirerek süpernatanı atın.</li>
	<li>Reaktif haznesinden 150 μL FACS tamponunda 96 oyuklu plaka üzerindeki peletleri yeniden süspanse etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. 6.4-6.5 arasındaki adımları iki kez tekrarlayın. 96 oyuklu plakayı ışıktan korunan buz dolu bir kutuya yerleştirin.</li>
	<li>Floresan raportörlerin popülasyon dağılımlarını elde etmek için örnekleri bir akış sitometresinden geçirin.<ol><li>Sitometrenin gerçekleştirilecek deney için lazer ve filtre kombinasyonları açısından uygun olduğundan emin olun (örneğin, uzak kırmızı spektrumda uyarmak veya tespit etmek mümkün değilse kızılötesi raportör kullanmayın).</li>
		<li>Analiz sırasında verilerin MEFL dönüşümüne izin vermek için standardizasyon boncukları için ek numuneler ekleyin. Uygun istatistiksel analiz için numune başına yeterli hücrenin toplandığından emin olun9.</li>
	</ol></li>
	<li>Ham sitometre dosyalarından floresan birimleri dönüştürün ve Python veya MATLAB tabanlı boru hatları veya ticari olarak temin edilebilen yazılımlar 9,13 gibi çeşitli yöntemlerden herhangi birini kullanarak verileri analiz edin.</li>
</ol>

mPSC'lerde İleri ve Geri Transfeksiyon Yöntemlerinin Karşılaştırmalı Analizi

<ol>
	<li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design:+Engineering+the+mammalian+cell.">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li><li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro.">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li><li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Tamm, C., Galit&#243;, S. P., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing.">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156 (2013).</li><li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+pluripotency:+in+vitro+adaptations+of+a+continuum+of+in+vivo+states.">The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states.</a> BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).</li><li>Mulas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+propagation+and+manipulation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells.</a> Development. 146 (6), 173146 (2019).</li><li>Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galit&#243;, S., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+efficient+transfection+of+mouse+embryonic+stem+cells+using+non-viral+reagents.">Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).</li><li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165 (2021).</li><li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;poly-transfection&amp;#34;+method+for+rapid,+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems.">A &amp;#34;poly-transfection&amp;#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).</li><li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells.">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).</li><li>Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+cell+state+identification+circuits+with+poly-transfection.">Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (192), e64793 (2023).</li><li>Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics.">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li><li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoflow:+A+python+toolbox+for+flow+cytometry.">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter.">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611 (2010).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Transfeksiyon protokollerinin yaygın olarak benimsenmesinin temel nedeni, tekrarlanabilirlikleri ve erişilebilirlikleridir; Ancak, bu protokoller deneysel bağlamlarda optimizasyon gerektirir. Yukarıda bahsedilmeyen, yeni bir hücre hattını ilk kez kesmeye çalışırken gerekli olan standart testtir. İlk olarak, transfeksiyon reaktifi seçimi çok önemlidir, çünkü ticari olarak temin edilebilen reaktifler herkese uyan tek bir beden değildir ve hücre tipleri arasında NA iletim canlılığının verimliliğin...

DNA ve RNA'nın memeli hücrelerine verilmesi, biyomedikal araştırmaların temel direği olarak hizmet eder1. Ekzojen nükleik asitleri (NA) memeli hücrelerine sokmak için yaygın bir yöntem, geçici transfeksiyon 2,3'tür. Bu teknik, NA'nın alıcı hücrelere iletebilen ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karıştırılmasına dayanır. Tipik olarak, NA, iki boyutlu bir yüzeye yapışan hücrelerin transfeksiyon kompleksini aldığı ileri transfeksiyon yoluyla iletilir. En yaygın olarak kurulan hücre hatları için ileri transfeksiyon sağlam ve protokoller iyi yayınlanmış olsa da, tek tabakalı olmayan morfolojilere sahip daha niş hücre tipleri kolayca transfekte olmaz, bu da verilebilecek NA miktarını ve onu alan hücre sayısını sınırlar.
Pluripotent kök hücreler (PSC'ler), süresiz olarak bölünme ve herhangi bir vücut hücresi tipi üretme yetenekleri göz önüne alındığında, gelişimi anlamak için çekici bir model ve rejeneratif tıp için bir araç olarak hizmet eder. Fare PSC'leri (mPSC'ler) için, 2 inhibitör ve LIF (2i/LIF) içeren rutin in vitro kültür koşulları, kubbe benzeri bir koloni morfolojisini koruyarak ileri transfeksiyona maruz kalan hücre sayısını doğrudan sınırlar 4,5,6. Bunu ele almak için, bir ters transfeksiyon gerçekleştirilebilir: hücreler, yapışkan hücrelere transfeksiyon reaktifi eklemek yerine, ortam ve transfeksiyon reaktifi içeren bir kabaeklenir 7. Bu, reaktife maruz kalan hücre sayısını artırırken, aynı zamanda hücrelerin aynı anda geçişini ve transfekte edilmesini gerektirir.
Basit tek NA transfeksiyonlarının ötesine geçerek, araştırmacılar genellikle birkaç NA yapısını in vitro bir hücre popülasyonuna iletmeyi amaçlarlar. Bu tipik olarak, NA'ların belirli bir oranda (1:1, 9:1, vb.) karıştırıldığı ve daha sonra seçilen transfeksiyon reaktifi8 ile birleştirildiği bir ko-transfeksiyon yoluyla elde edilir. Bu, NA'ların orijinal oranını koruyan bir NA ve reaktif karışımı verir - tedavideki hücreler bu karışımın farklı miktarlarını alabilirken, hepsi aynı oranıalır 9. İstenilen parça oranı bilindiğinde bu avantajlı olsa da, bu oranın önceden belirlenmesi emek yoğun olabilir ve her oran farklı bir koşul oluşturur. Bir alternatif, tek tek NA'ların transfeksiyon reaktifi ile birbirinden bağımsız olarak karıştırıldığı bir "poli-transfeksiyon" gerçekleştirmektir9. Araştırmacılar, tek tek NA'ları içeren transfeksiyon komplekslerini birleştirerek (kompleksleri oluşturmadan önce NA'ları birleştirmek yerine), tek bir transfeksiyon deneyinde çok çeşitli NA stokiyometrilerini keşfedebilirler9. Bu, indüklenebilir transkripsiyon sistemleri veya 1,10,11'de yerleşik geri beslemeli sistemler gibi birkaç NA'nın ürünlerinin birbiriyle etkileşime girmesinin beklendiği durumlarda özellikle değerlidir. Bununla birlikte, bunu etkili bir şekilde yapmak için yüksek bir transfeksiyon verimliliğine ihtiyaç vardır. Gerçekten de, benzersiz transfekte edilmiş NA'ların sayısı arttıkça, belirli bir hücrenin istenen tüm NA'ları alma olasılığı katlanarakazalır 9,12.
Aşağıdaki rapor, canlılığı en üst düzeye çıkarmak ve tipik kültür koşullarının dışındaki süreyi en aza indirmek için hücrelerin maksimum 5 dakika boyunca reaktif-NA karışımına maruz bırakıldığı katyonik lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanan mPSC'ler için bir ters transfeksiyon protokolünü açıklamaktadır. Bu protokolün bu hücrelerin standart ileri transfeksiyonu ile karşılaştırılması, daha yüksek bir transfeksiyon verimliliği ve hayatta kalan transfekte edilmiş hücrelerin toplam sayısında bir artış olduğunu göstermektedir. Bu ters transfeksiyonu, basit floresan raportörleri içeren üç plazmit poli-transfeksiyon ile birleştirerek, NA oranlarını yüksek transfeksiyon verimliliği ile taramak için genişletilmiş bir potansiyel gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apotransferrin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T1147-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction V (7.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SML1046-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D6421-24X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry standardization beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URCP-38-2K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>PZ0162-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6780</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mLIF&#160;</td>
			<td>BioTechne</td>
			<td>8878-LF-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S5261-25G</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized mouse embryonic stem cell based reverse poly-transfection technique for rapid exploration of nucleic acid ratios

Göreceli basitliği ve kullanım kolaylığı nedeniyle, memeli hücre hatlarının nükleik asitlerle geçici transfeksiyonu, biyomedikal araştırmalarda bir dayanak noktası haline gelmiştir. Yaygın olarak kullanılan hücre hatlarının çoğu, yapışık iki boyutlu kültürde transfeksiyon için sağlam protokollere sahip olsa da, bu protokoller genellikle daha az çalışılmış hatlara veya atipik, transfekte edilmesi zor morfolojilere sahip olanlara iyi tercüme edilmez. Rejeneratif tıp için yaygın olarak kullanılan bir kültür modeli olan 2i/LIF ortamında büyütülen fare pluripotent kök hücrelerini kullanan bu yöntem, daha yüksek transfeksiyon verimliliği elde edebilen optimize edilmiş, hızlı bir ters transfeksiyon protokolünü ana hatlarıyla belirtir. Bu protokolden yararlanarak, genişletilmiş bir plazmit stokiyometri aralığını incelemek için plazmit dağıtımındaki normalden daha yüksek verimlilikten yararlanılarak üç plazmit poli-transfeksiyonu gerçekleştirilir. Bu ters poli-transfeksiyon protokolü, kullanıcıların plazmit oranlarını birkaç ko-transfeksiyon yerine tek bir kuyuda optimize etmelerini sağlayan tek kap deneysel bir yönteme izin verir. DNA stokiyometrisinin iletilen genetik devrelerin genel işlevi üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırarak, bu protokol embriyonik kök hücre transfeksiyonunun süresini ve maliyetini en aza indirir.

Delivery of DNA and RNA into mammalian cells serves as a core pillar of biomedical research1. A common method for introducing exogenous nucleic acids (NA) into mammalian cells is through transient transfection2,3. This technique relies on mixing NA with commercially available transfection reagents capable of delivering them into the recipient cells. Typically, NA is delivered via forward transfection, where cells adhering to a two-dimensional surface receive the transfection complex. While forward transfection for the most common established cell lines is robust and protocols are well-published, more niche cell types with non-monolayer morphologies do not transfect easily, limiting the amount of NA that can be delivered and the number of cells that receive it.
Pluripotent stem cells (PSCs) serve as an attractive model for understanding development and as a tool for regenerative medicine, given their ability to divide indefinitely and produce any bodily cell type. For mouse PSCs (mPSCs), routine in vitro culture conditions with 2 inhibitors and LIF&#160;(2i/LIF) maintain a dome-like colony morphology, directly limiting the number of cells exposed to a forward transfection4,5,6. To address this, a reverse transfection can be performed: cells are added to a dish containing media and transfection reagent, rather than adding transfection reagent to adherent cells7. While this increases the number of cells exposed to the reagent, it also requires the cells to be passaged and transfected concurrently.
Moving beyond simple single-NA transfections, researchers often aim to deliver several NA constructs into a population of cells in vitro. This is typically achieved through a co-transfection, where the NAs are mixed at a given ratio (1:1, 9:1, etc.) and are then combined with the chosen transfection reagent8. This yields a mix of NAs and reagent that preserves the original ratio of NAs to one another - while cells in the treatment may receive different amounts of this mix, they all receive the same ratio9. While this is advantageous when the desired ratio of parts is known, determining this ratio ahead of time can be labor-intensive, with each ratio constituting a different condition. One alternative is to perform a &#34;poly-transfection,&#34; where individual NAs are mixed with the transfection reagent independently from one another9. By combining transfection complexes containing individual NAs (rather than combining NAs before creating the complexes), researchers can explore a wide array of NA stoichiometries in a single transfection experiment9. This is particularly valuable in cases where the products of several NAs are expected to interact with one another, such as with inducible transcription systems or systems with feedback built in1,10,11. However, to do so effectively, a high transfection efficiency is needed. Indeed, as the number of unique transfected NAs increases, the probability of a given cell receiving all of the desired NAs decreases exponentially9, 12.
The following report describes a reverse transfection protocol for mPSCs using a cationic lipid-based transfection reagent, in which cells are exposed to the reagent-NA mix for a maximum of 5 min to maximize viability and minimize the time outside of typical culture conditions. Comparing this protocol to the standard forward transfection of these cells demonstrates a higher transfection efficiency and an increase in the total number of surviving transfected cells. By combining this reverse transfection with a three-plasmid poly-transfection involving simple fluorescent reporters, an expanded potential to screen NA ratios with high transfection efficiency is demonstrated.

Yazar Spotlight: Kök Hücre Kader Manipülasyonu ve Hücresel Tedavi Geliştirme için Sentetik Genetik Cihazlardaki Gelişmeler

Nükleik Asit Oranlarının Hızlı Araştırılması için Optimize Edilmiş Bir Fare Embriyonik Kök Hücre Tabanlı Ters Poli-Transfeksiyon Tekniği

Our work generally focuses on using synthetic genetic devices to manipulate stem cell fate and behavior. By controlling cellular states, we aim to advance the development of next generation cellular therapies. Recently, a deeper understanding of the relationship between the dosage of a fate determining gene and the cell's lineage has been established.This was facilitated by the development of genetic controllers that are able to titrate a given gene precisely. Classic molecular biology techniques such as transfection or lentiviral transduction for simple gene over expression will always be a mainstay. However, our field has recently adopted synthetic devices that incorporate linear and non-linear feedback in order to obtain more complex outputs from delivered DNA.Gene dosage has a key role in determining the outcome of gene expression. When delivering multiple exogenous genes, a key experimental factor is how much of each gene will give the optimal or desired outcome. Our protocol allows researchers to rapidly scan across dosages in a single treatment, looking for the desired ratio of DNA devices.

Hem ileri hem de geri transfeksiyonlar, hücre zarı ile gelen transfeksiyon reaktifi-DNA kompleksleri arasındaki etkileşime dayanır ve NA'nın alıcı hücrelere iletilmesine izin verir. Bu tekniklerin farklı olduğu yer, hücrenin doğumdaki durumudur - DNA tipik olarak geleneksel ileri transfeksiyonda yapışık hücre tek katmanlarına iletilirken, ters transfeksiyon bunun yerine reaktif-DNA kompleksinin tek hücreli bir süspansiyon içindeyken hücrelerle buluşmasına dayanır. Bu fark, hücrelerin tekdüze, d...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios at JoVE.com

Mevcut protokol, 2i ve LIF ortamı ile kültür sırasında fare embriyonik kök hücrelerinin ters poli-transfeksiyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, geleneksel ileri transfeksiyon protokollerinden daha yüksek canlılık ve verimlilik sağlarken, aynı zamanda plazmit oranlarının tek kap optimizasyonunu da sağlar.

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

Çalışmalarımız genellikle kök hücre kaderini ve davranışını manipüle etmek için sentetik genetik cihazlar kullanmaya odaklanmaktadır. Hücresel durumları kontrol ederek, yeni nesil hücresel tedavilerin geliştirilmesini ilerletmeyi amaçlıyoruz. Son zamanlarda, kaderi belirleyen bir genin dozu ile hücrenin soyu arasındaki ilişkinin daha derin bir şekilde anlaşılması sağlanmıştır.Bu, belirli bir geni hassas bir şekilde titre edebilen genetik kontrolörlerin geliştirilmesiyle kolaylaştırılmıştır. Basit gen aşırı ekspresyonu için transfeksiyon veya lentiviral transdüksiyon gibi klasik moleküler biyoloji teknikleri her zaman bir dayanak noktası olacaktır. Bununla birlikte, alanımız son zamanlarda, iletilen DNA'dan daha karmaşık çıktılar elde etmek için doğrusal ve doğrusal olmayan geri beslemeyi içeren sentetik cihazları benimsemiştir.Gen dozajı, gen ekspresyonunun sonucunu belirlemede önemli bir role sahiptir. Birden fazla eksojen gen verirken, önemli bir deneysel faktör, her bir genin ne kadarının optimal veya istenen sonucu vereceğidir. Protokolümüz, araştırmacıların tek bir tedavide dozajlar arasında hızlı bir şekilde tarama yapmasına ve istenen DNA cihazı oranını aramasına olanak tanır.

an-optimized-mouse-embryonic-stem-cell-based-reverse-poly

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

678 Görüntüleme.  University of British Columbia. Çalışmalarımız genellikle kök hücre kaderini ve davranışını manipüle etmek için sentetik genetik cihazlar kullanmaya odaklanmaktadır. Hücresel durumları kontrol ederek, yeni nesil hücresel tedavilerin geliştirilmesini ilerletmeyi amaçlıyoruz. Son zamanlarda, kaderi belirleyen bir genin dozu ile hücrenin soyu arasındaki ilişkinin daha derin bir şekilde anlaşılması sağlanmıştır.Bu, belirli bir geni hassas bir şekilde titre edebilen genetik kontrolörlerin ...