تم تمويل هذا البحث من قبل NSF / CMMI Mechanobiology لناقلات الأكسجين الاصطناعي القائمة على الهيموجلوبين (# 1941655) و NSF / CMMI التحليل الديناميكي والتعب لخلايا الدم الحمراء الصحية والمريضة (# 1635312).

تم الحصول على الدم البشري الكامل غير المحدد تجاريا. وأجري العمل المتعلق بعينات الدم في مختبر من المستوى 2 للسلامة الأحيائية باستخدام البروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية في جامعة فلوريدا أتلانتيك.
1. إعداد جهاز الموائع الدقيقة
<ol><li>قم بلصق رقاقة السيليكون الرئيسية SU-8 لتصميم قناة الموائع الدقيقة داخل طبق بتري بلاستيكي مقاس 14 سم وقم بتنظيفه بغاز N2 .</li>
	<li>تزن 60 جم من قاعدة polydimethylsiloxane (PDMS) و 6 جم من عامل معالجة PDMS في كوب ورقي. اخلطي الجزأين باستخدام ملعقة خشبية حتى يصبح الخليط أبيض غائم.</li>
	<li>صب خليط PDMS في طبق بتري البلاستيكي الذي يحتوي على رقاقة السيليكون. ضع طبق بتري في مجفف مفرغ مع محبس 3 اتجاهات. أدر صمام المحبس لتوصيل الفراغ بغرفة التجفيف لإزالة فقاعات الهواء من PDMS.</li>
	<li>أعد إدخال الهواء إلى حجرة التجفيف عن طريق ضبط صمام المحبس لتوصيل غرفة المجفف بالمحيط في حوالي 5 دقائق دورات. كرر حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء من ميزات القنوات.</li>
	<li>ضع طبق بتري داخل فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. بمجرد انقضاء الوقت ، قم بإزالة طبق بتري ، واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، وضعه على حصيرة تقطيع.</li>
	<li>باستخدام مشرط ، اقطع جزء PDMS فوق رقاقة السيليكون. ضع PDMS المقطوع بين ورقتي فيلم تغليف المختبر. تسهل الفجوة المتكونة بين المسافة البادئة للقناة الدقيقة والفيلم شبه الشفاف تحديد موقع قناة الموائع الدقيقة بالإضافة إلى مدخلها ومخرجها.</li>
	<li>باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقطع قناة فردية من PDMS الكبير. قم بثقب مدخل 3 مم وفتحة مخرج 1.5 مم باستخدام لكمات الخزعة الخاصة بالحجمين (الشكل 1 أ).</li>
	<li>ضع القناة المثقوبة ، بحيث يكون جانب القناة متجها لأعلى ، على شريحة زجاجية نظيفة. ضع ركيزة زجاجية مقاس 20 مم × 15 مم تحتوي على أقطاب كهربائية متداخلة من أكسيد القصدير الإنديوم (ITO) ذات الأغشية الرقيقة على نفس الشريحة الزجاجية مع توجيه الأقطاب الكهربائية لأعلى.</li>
	<li>ضع الشريحة الزجاجية برفق مع PDMS والركيزة في منظف البلازما. أغلق صمام الغاز ، وقم بتشغيل مفتاح المضخة ، وانتظر 2 دقيقة للحصول على قراءة مستشعر من 600 - 800 mTorr.</li>
	<li>قم بتشغيل مفتاح الطاقة وانتظر 30 ثانية. أدر مقبض طاقة التردد اللاسلكي من منخفض إلى مرتفع وانتظر لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>بعد ذلك ، اعكس التسلسل عن طريق تدوير مقبض التردد اللاسلكي إلى المستوى المنخفض ، ومفتاح الطاقة إلى OFF ، ومفتاح المضخة إلى OFF ، وفتح صمام الغاز.</li>
	<li>مباشرة بعد فتح حجرة منظف البلازما ، ارفع وتدوير PDMS بحيث يكون جانب القناة متجها لأسفل (180 درجة). ضع القناة أعلى ركيزة ITO. بدأت عملية الترابط.</li>
	<li>باستخدام الملقط ، اضغط برفق على زوايا PDMS لمدة 3 ثوان تقريبا. تجنب الضغط على القناة نفسها. ملاحظة: تحدث عملية الترابط تلقائيا عند الاتصال الجسدي بين السطحين المعالجين.</li>
	<li>قم بتحميل وسيط التحضير في حقنة سعة 1 مل بإبرة 23 جرام. بلل القناة بعناية عن طريق إدخال الإبرة مباشرة في بئر المدخل ثم تحرير الوسيط. تعمل ببطء. لا تدخل فقاعات الهواء. احتضان لمدة 3 دقائق على الأقل.</li>
	<li>قم بإزالة الوسط الرئيسي باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر. اغسل القناة بوسيط DEP 3 مرات عن طريق إدخال وسيط DEP في القناة. حافظ على القناة رطبة في جميع الأوقات.</li>
</ol>2. اختبار لاعبا اساسيا
ملاحظة: تم تصميم تركيبات الاختبار باستخدام برنامج 3D CAD وتتضمن وحدة سكنية أساسية ووحدة علوية (الشكل 1B). بعد ذلك ، يتم تصنيعها باستخدام آلة طحن CNC ذات 3 محاور مع حد تسامح قياسي يبلغ حوالي ± يتم فحص أبعاد 0.005 بوصة من تركيبات الاختبار باستخدام الفرجار الإلكتروني (غير معروض). عقم لاعبا اساسيا غير مطلوب للاختبار الميكانيكي الحيوي في المختبر.
<ol><li>أسلاك ما قبل اللحام في نهايات كوب اللحام لمجموعتين من موصلات المكبس الزنبركية.</li>
	<li>أدخل موصلات مكبس الزنبرك في الوحدة العلوية وقم بإنشاء رابطة دائمة عن طريق إضافة قطرة من غراء الإيبوكسي.</li>
</ol>3. إعداد العازلة للعمل التشوه الكهربائي
<ol><li>لتحضير وسط DEP ، قم بوزن 12.75 جم من السكروز و 0.45 جم من سكر العنب باستخدام الميزان.</li>
	<li>قم بإذابة كلا المساحيق في وعاء واحد يحتوي على 150 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) و 3.5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).</li>
	<li>باستخدام جهاز اختبار الموصلية منخفضة المدى ، قم بقياس الموصلية وتأكد من أنها 0.04 ثانية / م (الشكل 2). ملاحظة: يمكن استخدام قيمة توصيل مختلفة ، والتي يمكن أن تغير علامة وحجم قوة DEP الناتجة11. ومع ذلك ، يتطلب التشوه الكهربائي قوة DEP موجبة.</li>
	<li>باستخدام مقياس الأسموزية ، تأكد من أن الأسمولية ضمن المعدل الطبيعي لبلازما الدم ، 275 إلى 295 mOsm / kg من الماء (الشكل 3). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. تم إعداد وسيط DEP الآن.</li>
	<li>في أنبوب سعة 15 مل ، قم بإذابة 0.5 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في 10 مل من وسط DEP. تخلط جيدا. تم الآن إعداد الوسيط الرئيسي للجهاز.</li>
</ol>4. إعداد تعليق الخلية
<ol><li>اغسل 20 ميكرولتر من الدم الكامل عن طريق الطرد المركزي للدم باستخدام 1 مل من PBS عند 268 × جم لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية.</li>
	<li>أعد تعليق كرات الدم الحمراء في 1 مل من PBS. ماصة بلطف لخلط. اغسل كرات الدم الحمراء لمدة 3 دقائق عند 268 × جم وتخلص من المادة الطافية.</li>
	<li>استخرج 5 ميكرولتر من حبيبات كرات الدم الحمراء باستخدام طرف ماصة صغيرة سعة 10 ميكرولتر ووزعها بالكامل في 1 مل من وسط DEP. اغسل الخلايا بالطرد المركزي عند 268 × جم لمدة 3 دقائق.</li>
	<li>تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كرات الدم الحمراء في 1 مل من وسط DEP. ماصة بلطف لخلط.</li>
	<li>اغسل كرات الدم الحمراء لمدة 3 دقائق عند 268 × جم وتخلص من المادة الطافية. ماصة 2 ميكرولتر من حبيبات كرات الدم الحمراء إلى 500 ميكرولتر من وسط DEP. يتم الآن تحضير معلق الخلية بتركيز في نطاق 62 - 104 خلية / ميكرولتر12 ، والتي يمكن تأكيدها باستخدام شريحة عد الخلايا القياسية.</li>
</ol>5. إعداد التشوه الكهربائي واختبار التعب
<ol><li>ضع جهاز الموائع الدقيقة في الجزء السفلي من تركيبات الاختبار. قم بمحاذاة الجزء العلوي من التركيب مع الجهاز وقم بتجميع الجزأين باستخدام مجموعتين من مسامير وصواميل النايلون (الشكل 4).</li>
	<li>ضع تركيبات الاختبار على مرحلة المجهر. حدد موقع مجموعة واحدة مرغوبة من الأقطاب الكهربائية تحت المجهر.</li>
	<li>قم بتوصيل الزوج المقابل من أسلاك القطب الكهربائي التي تطابق مجموعة القطب الموجودة بطرف الإخراج لمولد الوظيفة (الشكل 4).</li>
	<li>قم بإزالة 5 ميكرولتر من وسط DEP من مدخل 3 مم لقناة الموائع الدقيقة. قم بتحميل 5 ميكرولتر ببطء من تعليق الخلية في المدخل باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر.</li>
	<li>السماح للخلايا لتستقر لمدة 1 دقيقة. إذا لزم الأمر ، أضف وسيط DEP إضافيا إلى المدخل لدفع الخلايا إلى القناة.</li>
	<li>راقب القناة تحت تكبير 20x. استخدم مرشح تمرير النطاق 414/46 نانومتر لتحسين تباين التصوير.</li>
	<li>اضغط على زر الجيب وحدد موجة جيبية بسعة 2 فولتRMS بتردد 3 ميجاهرتز. اضغط على زر Mod لتمكين التعديل. قم بتغيير وضع الموجة إلى ASK بالضغط على خيار النوع .</li>
	<li>اضبط تردد التعديل على 250 ميجاهرتز ، وهو ما يتوافق مع فترة تحميل وتفريغ 4 ثوان (الشكل 5 أ). قم بتشغيل إخراج مولد الوظائف.</li>
	<li>سجل مقطع فيديو مدته 1 دقيقة كل 10 دقائق بمعدل 30 إطارا لكل ثانية (fps).</li>
</ol>6. توصيف تشوه كرات الدم الحمراء
<ol><li>باستخدام تطبيق تحرير الفيديو ، افتح .avi الملفات المسجلة في الخطوة السابقة بالضغط على Ctrl + O. استخدم المخطط الزمني لاختيار إطار اهتمام وقم بتعيين إطارات بداية التحديد ونهايته لتكون متطابقة بالضغط على مفتاح Home ثم مفتاح الإنهاء على لوحة المفاتيح.</li>
	<li>تصدير إطار الصورة. حدد تنسيق الإخراج ليكون JPEG واضغط على موافق.</li>
	<li>افتح تطبيق ImageJ وقم بتحميل الصور المحفوظة في الخطوة السابقة. ابدأ بتعيين القياسات المطلوبة بالضغط على تحليل > تعيين القياسات والتأكد من تحديد خانات الاختيار الخاصة بالمنطقة والمحيط واحتواء القطع الناقص . اضغط على موافق.</li>
	<li>بعد ذلك، قم بتحويل الصورة إلى درجات رمادية باختيار نوع > الصورة > 8 بت.</li>
	<li>ثم قم بتحويل الصورة إلى ثنائية باستخدام Image > ضبط > Thresholding. في شاشة العتبة، اضبط منزلقي التمرير حسب الحاجة. اضغط على تطبيق ثم أغلق مربع الحوار عتبة.</li>
	<li>اختر تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار، اضغط على مربع الاختيار المسمى إظهار الكل. لا تغلق هذا المربع.</li>
	<li>حدد أداة العصا (التتبع)، وحدد خلية قابلة للتطبيق في الصورة، واضغط على T على لوحة المفاتيح. سيتم ترقيم الخلية المحددة. يمكن تحديد خلية جديدة مرة أخرى. حدد جميع الخلايا القابلة للتطبيق المراد قياسها. يتم تحديد الخلايا القابلة للتطبيق على أنها تلك المعزولة عن الخلايا الأخرى. يمكن أن يتراوح عدد هذه الخلايا من 50 إلى 200 في مجال رؤية واحد.</li>
	<li>ارجع إلى مربع مدير عائد الاستثمار واضغط على قياس. يؤدي هذا إلى فتح مربع النتائج. الأعمدة المسماة الرئيسية والصغرى هي أطوال المحاور الرئيسية والثانوية القطعية المجهزة (بالبكسل) ، على التوالي. اختر ملف > حفظ باسم لتصدير القياسات كملف بتنسيق CSV.</li>
	<li>باستخدام أي برنامج تحليل حسابي مناسب ، احسب حاصل قسمة التخصص الرئيسي والثانوي.</li>
</ol>

اختبار التعب الميكانيكي لكرات الدم الحمراء عن طريق التشوه الكهربائي المعدل السعة

<ol>
	<li>Kim, Y., Kim, K., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+techniques+for+red+blood+cell+deformability:+recent+advances.">Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances.</a> Blood Cell&#8212;An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).</li><li>Safeukui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+sensing+and+sequestration+of+spherocytic+erythrocytes+by+the+human+spleen.">Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).</li><li>Naghedi-Baghdar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diet+on+blood+viscosity+in+healthy+humans:+a+systematic+review.">Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review.</a> Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).</li><li>Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+red+cell+lifespan+and+aging.">Measurement of red cell lifespan and aging.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).</li><li>Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+measuring+red+blood+cell+deformability.">Technologies for measuring red blood cell deformability.</a> Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).</li><li>Kim, J., Lee, H., Shin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+measurement+of+red+blood+cell+deformability:+A+brief+review.">Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review.</a> Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).</li><li>Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+diversity+of+osmotic+gradient+deformability+of+red+blood+cells+in+human+and+seven+vertebrate+animal+species.">Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species.</a> Cells. 11 (8), 1351 (2022).</li><li>Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+measurement+of+individual+cells+in+large+populations+using+a+single-cell+microchamber+array+chip.">Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).</li><li>Al Safi, A., Bazuin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+digital+transmitters+with+amplitude+shift+keying+and+quadrature+amplitude+modulators+implementation+examples.">Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples.</a> , 1-7 (2017).</li><li>Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+isolation+and+analysis.">Circulating tumor cell isolation and analysis.</a> Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).</li><li>Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Fr&#233;n&#233;a-Robin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyDEP:+a+new+computational+tool+for+dielectric+modeling+of+particles+and+cells.">MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells.</a> Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).</li><li>Haywood, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+full+blood+count.">Interpreting the full blood count.</a> InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).</li><li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+fatigue+of+human+red+blood+cells.">Mechanical fatigue of human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).</li><li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique.">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).</li><li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+for+single-cell+characterization+of+impaired+deformability+in+red+blood+cells+under+recurrent+episodes+of+hypoxia.">In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يمكن استخدام تعديل ASK OOK لموجة جيبية تحفز قوة DEP لاختبار التعب الميكانيكي لكرات الدم الحمراء على مدى فترة طويلة من الزمن. في هذا البروتوكول ، قصرنا اختبار التعب في المختبر على 1 ساعة لمنع الآثار الأيضية الضارة المحتملة على تشوه الخلية. يمكن برمجة ظروف اختبار التعب الشاملة باستخدام تقنية الت...

خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) هي أكثر الخلايا تشوها في جسم الإنسان1. ترتبط قابليتها للتشوه ارتباطا مباشرا بوظائفها في حمل الأكسجين. تم العثور على انخفاض التشوه في كرات الدم الحمراء ليرتبط مع التسبب في العديد من اضطرابات كرات الدمالحمراء 2. قادتنا قياسات التشوه إلى فهم أفضل للأمراض المرتبطة بكرات الدم الحمراء3. يمكن أن يختلف العمر الطبيعي لكرات الدم الحمراء من 70 إلى 140 يوما4. لذلك ، من المهم قياس كيفية انخفاض قابليتها للتشوه جنبا إلى جنب مع عملية الشيخوخة ، على سبيل المثال ، سلوك التعب بسبب إجهادات القص الدورية3.
يعد قياس تشوه كرات الدم الحمراء عند الإنتاجية العالية أمرا صعبا بسبب قوى مقياس piconewton (~ 10-12 N) التي يتم تطبيقها على الخلايا الفردية. على مدى العقد الماضي ، تم تطوير العديد من التقنيات لقياس تشوه الخلايا5. يمكن إجراء قياسات تشوه كرات الدم الحمراء على مستوى الخلية الواحدة عن طريق شفط الماصة والملاقط البصرية ، بينما يتم إجراء التحليلات السائبة عن طريق قياس التدرج التناضحي. توفر تحليلات قياس كتكتاوات الدم وفرة من البيانات ، مما يوفر فرصة لتشخيص اضطرابات الدم 6,7. يمكن أيضا تحليل تشوه كرات الدم الحمراء باستخدام نظرية المرونة اللزجة بواسطة مجهر القوة الذرية للمسبار الغرواني. في هذه الطريقة ، يتم تطبيق التحليل الحسابي لتقدير معامل المرونة لكرات الدم الحمراء ، مع الأخذ في الاعتبار كل من الاستجابات المعتمدة على الوقت والحالة المستقرة. يمكن قياس تشوه كرات الدم الحمراء الفردية باستخدام طريقة صفيف الغرفة الدقيقة أحادية الخلية. تحلل هذه الطريقة كل خلية من خلال الغشاء وعلامات الفلورسنت الخلوية لتوفير معلومات عن تشوه كرات الدم الحمراء وتوزيع الخصائص الخلوية في مجموعات كرات الدم الحمراء المعقدة للكشف عن الاضطرابات الدموية8.
التعب هو عامل رئيسي في تدهور خصائص المواد الهندسية والمواد الحيوية. يتيح اختبار التعب إجراء تحليل كمي لسلامة وطول عمر الهيكل المعرض للتحميل الدوري. لطالما تم إعاقة تحليل التعب في الخلايا البيولوجية بسبب عدم وجود طريقة عامة وقابلة للتطبيق بسهولة وإنتاجية عالية وكمية لتنفيذ التشوه الدوري في أغشية الخلايا. هذا ممكن مع استخدام تعديل الإشارة الكهربائية وتقنيات التشوه الكهربائي المنفذة في بيئة الموائع الدقيقة. يتم تطبيق تقنية مفتاح إزاحة السعة (ASK) كتعديل رقمي من خلال تعديل مفتاح On-Off (OOK) في هذه المقالة. يشير مفهوم المفاتيح إلى إرسال الإشارات الرقمية عبر القناة ، الأمر الذي يتطلب إشارة حاملة موجة جيبية لتعمل9. يمكن ضبط أوقات التشغيل والإيقاف على قدم المساواة. تحت ON-keying ، تدخل كرات الدم الحمراء في حالة مشوهة أثناء تعرضها لقوة تشوه كهربائي خارجي (Fdep) 10 تم إنشاؤها بواسطة المجال الكهربائي غير المنتظم. تحت OFF-keying ، تكون كرات الدم الحمراء في حالة استرخاء. نلاحظ إجهاد كرات الدم الحمراء ، أي التدهور التدريجي في قدرتها على التمدد مع زيادة دورات التحميل. يمكن أن يوفر فقدان التشوه الناجم عن التعب في كرات الدم الحمراء نظرة ثاقبة على تلف الغشاء المتراكم أثناء الدورة الدموية ، مما يمكننا من إجراء مزيد من التحقيق في الروابط بين إجهاد الخلايا وحالات المرض.
نقدم هنا إجراءات خطوة بخطوة حول كيفية تنفيذ اختبار التعب لكرات الدم الحمراء في جهاز الموائع الدقيقة عبر التشوه الكهربائي المعدل ASK وإعدادات النظام مثل جهاز الموائع الدقيقة ، والتحميل الميكانيكي ، والتخيل المجهري لتوصيف التدهور التدريجي في التشوه الميكانيكي لكرات الدم الحمراء.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balance Scale</td>
			<td>ViBRA</td>
			<td>HT-224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>BRIGHTLINE</td>
			<td>414/46 BrightLine HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok&#8482; Tips, 1 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td>1.5 mm and 3 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle, 23-gauge</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X001308N97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>RMBIO</td>
			<td>BSA-BSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>911015119999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MDX01455</td>
			<td>MilliporeSigma&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Low Conductivity meter</td>
			<td>ecoTestr</td>
			<td>358/03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160; &#160;Snap-Cap MicrocentrifugeTubes</td>
			<td>www.eppendorf.com</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Graph plotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>SIGLENT</td>
			<td>SDG830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/ITO Electrode Substrate</td>
			<td>OSSILA</td>
			<td>S161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX81 - SN9E07015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Oven</td>
			<td>QUINCY LAB (QL)</td>
			<td>MODEL 30GCE</td>
			<td>Digital Model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Graph plotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Osmometer - Model 3300</td>
			<td>Advanced Instruments Inc.</td>
			<td>S/N: 03050397P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Laboratory Wrapping Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>SKU=351006</td>
			<td>ICSI/Biopsydish 50*9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>04-479Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick plasma PDCOOL</td>
			<td>NC0301989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>CAD software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-188-2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>SPBEL-ART</td>
			<td>F42400-2121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0304136</td>
			<td>Tongue Depressors Wood NS 6&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplitude-modulated electrodeformation to evaluate mechanical fatigue of biological cells

تشتهر خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) بتشوهها الملحوظ. يتعرضون مرارا وتكرارا لتشوه كبير عند المرور عبر دوران الأوعية الدقيقة. يظهر انخفاض التشوه في كرات الدم الحمراء المسنة من الناحية الفسيولوجية. لا يمكن بسهولة استخدام التقنيات الحالية لقياس تشوه الخلايا لقياس التعب ، والتدهور التدريجي في أغشية الخلايا الناجم عن الأحمال الدورية. نقدم بروتوكولا لتقييم التدهور الميكانيكي في كرات الدم الحمراء من إجهادات القص الدورية باستخدام التشوه الكهربائي القائم على تعديل مفتاح إزاحة السعة (ASK) في قناة الموائع الدقيقة. باختصار ، يتم إثارة الأقطاب الكهربائية المتداخلة في قناة الموائع الدقيقة بتيار متناوب منخفض الجهد عند ترددات الراديو باستخدام مولد إشارة. تستجيب كرات الدم الحمراء المعلقة للمجال الكهربائي وتظهر رحلان كهربائي إيجابي (DEP) ، والذي ينقل الخلايا إلى حواف القطب. ثم تتمدد الخلايا بسبب القوى الكهربائية التي تمارس على نصفي الخليتين ، مما يؤدي إلى تمدد أحادي المحور ، يعرف باسم التشوه الكهربائي. يمكن تعديل مستوى إجهاد القص والتشوه الناتج بسهولة عن طريق تغيير سعة موجة الإثارة. وهذا يتيح تحديد كميات التشوه غير الخطي لكرات الدم الحمراء استجابة للتشوهات الصغيرة والكبيرة عند الإنتاجية العالية. يؤدي تعديل موجة الإثارة باستخدام إستراتيجية ASK إلى حدوث تشوه كهربائي دوري بمعدلات تحميل وترددات قابلة للبرمجة. هذا يوفر طريقة مريحة لتوصيف التعب كرات الدم الحمراء. يتيح نهج التشوه الكهربائي المعدل ASK الخاص بنا ، لأول مرة ، قياسا مباشرا لإجهاد كرات الدم الحمراء من الأحمال الدورية. يمكن استخدامه كأداة للاختبار الميكانيكي الحيوي العام ، لتحليل تشوه الخلايا والتعب في أنواع الخلايا الأخرى والظروف المرضية ، ويمكن أيضا دمجه مع استراتيجيات للتحكم في البيئة المكروية للخلايا ، مثل توتر الأكسجين والإشارات البيولوجية والكيميائية.

Red blood cells (RBCs) are the most deformable cells in the human body1. Their deformability is directly related to their oxygen-carrying functionality. Reduced deformability in RBCs has been found to correlate with the pathogenesis of several RBC disorders2. Deformability measurements have led us to a better understanding of RBC-related diseases3. The normal lifespan of RBCs can vary from 70 to 140 day4. Therefore, it is important to measure how their deformability decreases along with the aging process, e.g., their fatigue behavior due to cyclic shear stresses3.
Measuring RBC deformability at high throughput is challenging because of the piconewton scale forces (~10-12 N) that are applied to the individual cells. Over the past decade, many technologies have been developed to measure cell deformability5. Deformation measurements of RBCs at the single-cell level can be performed by pipette aspiration and optical tweezers, while bulk analyses are done by osmotic gradient ektacytometry. Ektacytometry analyses provide an abundance of data, which provides an opportunity to diagnose blood disorders6,7. The deformability of RBCs can also be analyzed using the viscoelastic theory by colloid probe atomic force microscopy. In this method, computational analysis is applied to estimate the elastic modulus of RBCs, considering both time-dependent and steady-state responses. The deformability of individual RBCs can be measured by using the single-cell microchamber array method. This method analyzes each cell through the membrane and cytosolic fluorescent markers to provide information for RBC deformability and the distribution of cellular characteristics in complex RBC populations to detect hematologic disorders8.
Fatigue is a key factor in the degradation of properties of engineered materials and biomaterials. Fatigue testing enables a quantitative analysis of the integrity and longevity of a structure subjected to cyclic loading. Analysis of fatigue in biological cells has long been hampered by the lack of a general, readily applicable, high throughput, and quantitative method for the implementation of cyclic deformation in cell membranes. This is possible with the utilization of electrical signal modulation and electrodeformation techniques implemented in a microfluidic setting. The amplitude shift keying (ASK) technique as a digital modulation is applied through On-Off keying (OOK) modulation in this article. The concept of keying refers to the transmission of digital signals over the channel, which requires a sine wave carrier signal to function9. The ON and OFF times can be set equal. Under ON-keying, RBCs enter a deformed state while exposed to an external electrodeformation force (Fdep)10 created by the nonuniform electric field. Under OFF-keying, RBCs are in their relaxed state. We observe the fatigue of RBCs, namely a progressive degradation in their ability to stretch with increasing loading cycles. The fatigue-induced deformability loss in RBCs can provide insights into the accumulated membrane damage during blood circulation, enabling us to further investigate the connections between cell fatigue and disease states.
Here we provide step-by-step procedures on how fatigue testing of RBCs is implemented in a microfluidic device via ASK-modulated electrodeformation and the system settings such as microfluidic device, mechanical loading, and microscopic imagining for the characterization of the gradual degradation in mechanical deformability of RBCs.

تسليط الضوء على المؤلف: دراسة الميكانيكا الحيوية للخلايا المتداولة عن طريق تعديل سلوك التشوه الكهربائي 

تشوه كهربائي معدل السعة لتقييم التعب الميكانيكي للخلايا البيولوجية

Our research is focused on the study of cell biomechanics of circulating cells, such as human red blood cells. We leverage electrokinetics, microfluidics, and material science to understand the mechanical origins of damage in cell membranes, as well as the mechanisms underlying the shortened lifespan of blood cells in certain diseases. Fatigue study of biological cells is challenging.It request application of cyclic loads to cell membranes and tracking the deformation in individual cells. Using amplitude sheet key for ASK to modulate electrode deformation behavior of red blood cells, we could quantify how cell deformability changes aligned with the loading cycles. We demonstrated for the first time that red blood cells'membranes can be degraded by cyclic stretching alone.Our protocol utilizes dielectrophoresis to move cells to the electrode edges for electrode deformation measurement. It does not require any stabilization technique and can be used for cell suspension directly. Using interdigitated microelectrodes allows us to measure tens of cells in a single field of view.

عندما تم تحميل تعليق الخلية في قناة الموائع الدقيقة ، لوحظ توزيع موحد نسبيا للخلايا. عند خرج الإشارة (على سبيل المثال ، موجة جيبية بسيطة أو مرحلة On-Keying من ASK) من مولد الوظائف ، ولدت الأقطاب الكهربائية ذات الأغشية الرقيقة المتداخلة مجالا كهربائيا غير منتظم للتيار المتردد. استجابت الخلايا ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Biomechanics of Circulating Cells by Modulating Their Electrodeformation Behavior at JoVE.com

يظهر هنا بروتوكول لاختبار التعب الميكانيكي في حالة خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام نهج التشوه الكهربائي المعدل السعة. يمكن استخدام هذا النهج العام لقياس التغيرات المنهجية في الخصائص المورفولوجية والميكانيكية الحيوية للخلايا البيولوجية في تعليق من التشوه الدوري.

Red blood cells (RBCs) are known for their remarkable deformability. They repeatedly undergo considerable deformation when passing through the ...

يركز بحثنا على دراسة الميكانيكا الحيوية للخلايا المنتشرة ، مثل خلايا الدم الحمراء البشرية. نحن نستفيد من الحركية الكهربائية ، وعلم الموائع الدقيقة ، وعلوم المواد لفهم الأصول الميكانيكية للتلف في أغشية الخلايا ، وكذلك الآليات الكامنة وراء تقصير عمر خلايا الدم في بعض الأمراض. دراسة التعب من الخلايا البيولوجية أمر صعب.يطلب تطبيق الأحمال الدورية على أغشية الخلايا وتتبع التشوه في الخلايا الفردية. باستخدام مفتاح ورقة السعة ل ASK لتعديل سلوك تشوه القطب الكهربائي لخلايا الدم الحمراء ، يمكننا تحديد كيفية تغير تشوه الخلايا بما يتماشى مع دورات التحميل. لقد أثبتنا لأول مرة أن أغشية خلايا الدم الحمراء يمكن أن تتحلل عن طريق التمدد الدوري وحده.يستخدم بروتوكولنا الرحلان الكهربائي لنقل الخلايا إلى حواف القطب لقياس تشوه القطب. لا يتطلب أي تقنية تثبيت ويمكن استخدامه لتعليق الخلية مباشرة. يسمح لنا استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتداخلة بقياس عشرات الخلايا في مجال رؤية واحد.

amplitude-modulated-electrodeformation-to-evaluate-mechanical-fatigue

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Bioengineering

Amplitude-Modulated Electrodeformation to Evaluate Mechanical Fatigue of Biological Cells

Unit 1

Operational Amplifiers

SCIENTISTS IN ACTION

1.0K Views.  Florida Atlantic University. يركز بحثنا على دراسة الميكانيكا الحيوية للخلايا المنتشرة ، مثل خلايا الدم الحمراء البشرية. نحن نستفيد من الحركية الكهربائية ، وعلم الموائع الدقيقة ، وعلوم المواد لفهم الأصول الميكانيكية للتلف في أغشية الخلايا ، وكذلك الآليات الكامنة وراء تقصير عمر خلايا الدم في بعض الأمر...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: دراسة الميكانيكا الحيوية للخلايا المتداولة عن طريق تعديل سلوك التشوه الكهربائي 

Red blood cells (RBCs) are known for their remarkable deformability. They repeatedly undergo considerable deformation when passing through the microcirculation. Reduced deformability is seen in physiologically aged RBCs. Existing techniques to measure cell deformability cannot easily be used for measuring fatigue, the gradual degradation in cell membranes caused by cyclic loads. We present a protocol to evaluate mechanical degradation in RBCs from cyclic shear stresses using amplitude shift keying (ASK) modulation-based electrodeformation in a microfluidic channel. Briefly, the interdigitated electrodes in the microfluidic channel are excited with a low voltage alternating current at radio frequencies using a signal generator. RBCs in suspension respond to the electric field and exhibit positive dielectrophoresis (DEP), which moves cells to the electrode edges. Cells are then stretched due to the electrical forces exerted on the two cell halves, resulting in uniaxial stretching, known as electrodeformation. The level of shear stress and the resultant deformation can be easily adjusted by changing the amplitude of the excitation wave. This enables quantifications of nonlinear deformability of RBCs in response to small and large deformations at high throughput. Modifying the excitation wave with the ASK strategy induces cyclic electrodeformation with programmable loading rates and frequencies. This provides a convenient way for the characterization of RBC fatigue. Our ASK-modulated electrodeformation approach enables, for the first time, a direct measurement of RBC fatigue from cyclic loads. It can be used as a tool for general biomechanical testing, for analyses of cell deformability and fatigue in other cell types and diseased conditions, and can also be combined with strategies to control the microenvironment of cells, such as oxygen tension and biological and chemical cues.

Presented here is a protocol for mechanical fatigue testing in the case of human red blood cells using an amplitude-modulated electrodeformation approach. This general approach can be used to measure the systematic changes in morphological and biomechanical characteristics of biological cells in a suspension from cyclic deformation.

Preparation of Dielectrophoresis Medium and Electrodeformation Prime Medium

To prepare the dielectrophoresis, or DEP medium, weigh 12.75 grams of sucrose and 0.45 grams of dextrose using a scale. Dissolve both powders in a solution of 150 milliliters of deionized water and 3.5 milliliters of PBS. Using a low-range conductivity tester, measure the conductivity to ensure it is 0.04 siemens per meter.Using an osmometer, confirm that the osmolarity is within the normal range of the blood plasma. Store the prepared DEP medium at four degrees Celsius. In a 15-milliliter tube, dissolve 0.5 grams of bovine serum albumin in 10 milliliters of the DEP medium, and mix thoroughly using a vortex mixer to prepare the device's prime medium.

إعداد ثنائي الكهربائي المتوسطة والتشوه الكهربائي رئيس المتوسطة

Preparation of the Microfluidic Device for Electrodeformation of RBCs

To begin, tape the SU8 master silicon wafer for the microfluidic channel design on the inside of a plastic 14-centimeter Petri dish and clean it with nitrogen gas. Weigh appropriate amounts of polydimethylsiloxane, or PDMS base and PDMS curing agent, in a paper cup. Using a wooden spatula, mix the two until the mixture becomes cloudy white in color.Pour the PDMS mixture into the plastic Petri dish containing the silicon wafer. Then, place the Petri dish into a vacuum desiccator equipped with a three-way stopcock. Turn the valve of the stopcock to connect the vacuum to the desiccator chamber to remove air bubbles from the mixture.Once all air bubbles are removed from the features of the channels, place the Petri dish inside an oven at 70 degrees Celsius for four hours. After the Petri dish cools to room temperature, place it on a cutting mat. Using a scalpel, cut out the portion of the PDMS above the silicon wafer.Place the cut-out PDMS between two sheets of the lab wrapping film. The gap between the indent of the microchannel and the film helps to locate the inlet and outlet of the microfluidic channel. Next, using a razor blade, cut out an individual channel from the large PDMS and, with respective biopsy punches, make appropriate inlet and outlet holes in the channel.Place the hole-punched channel with the channel side facing up onto a clean glass slide. Place a glass substrate containing thin film indium-tin oxide, or ITO interdigitated electrodes, on the same slide with the electrodes facing up. Then, gently place the glass slide into a plasma cleaner.After closing the gas valve and switching on the pump, wait for two minutes to obtain a sensor reading of 600 to 800 millitorr. Next, turn on the power switch and wait 30 seconds before turning the RF power knob from low to high and waiting for one minute. Then, to switch off the set, follow the reverse sequence.Immediately after opening the chamber of the plasma cleaner, lift and rotate the PDMS 180 degrees so that the channel side is facing down. Place the channel on the top of the ITO substrate to initiate the bonding process. Using tweezers, gently press down on the corners of the PDMS for about three seconds.Load the priming medium into a one-milliliter syringe with a 23-gauge needle. Slowly and carefully wet the channel by inserting the needle straight into the inlet well before releasing the medium without introducing air bubbles. After incubating for at least three minutes, remove the prime medium using a 10-microliter pipette tip.Finally, wash the channel with dielectrophoresis medium three times by inserting the medium into the channel.

تحضير جهاز الموائع الدقيقة للتشوه الكهربائي لكرات الدم الحمراء

Preparation of Human RBC Suspension for Electrodeformation Experiment

To begin wash 20 microliters of the whole blood by centrifuging it with one milliliter of PBS at 268 G for three minutes. Then discard the supernatant. Resuspend the resultant red blood cells, or RBCs, in one milliliter of PBS by gentle pipetting.Wash the RBCs again and discard the supernatant as demonstrated previously. Using a 10-microliter micro-pipette tip, extract five microliters of RBC pellet and fully dispense it into one milliliter of the dielectrophoresis, or DEP, medium. Wash the cells and discard the supernatant as demonstrated.Resuspend the pelleted RBCs in one milliliter of DEP medium by gentle pipetting. After washing the cells and discarding the supernatant, pipette two microliters of RBC pellet into 500 microliters of DEP medium. Confirmed the concentration of the resulting cell suspension using a standard cell counting slide.

إعداد تعليق كرات الدم الحمراء البشري لتجربة التشوه الكهربائي

Preparing the Electrodeformation Setup and Performing Fatigue Testing on Human RBC

To begin, place the microfluidic device into the bottom part of the test fixture. Align the top part of the fixture onto the device, and using two sets of nylon screws and nuts, assemble the two parts. Place the test fixture on the microscope stage.Locate one desired set of electrodes under the microscope. Connect the corresponding pair of electrode wires that match the located electrode set to the output terminal of the function generator. Remove five microliters of the dielectrophoresis, or DEP medium, from the three-millimeter inlet of the microfluidic channel.Using a 10-microliter pipette tip, slowly load five microliters of the prepared red blood cell, or RBC suspension, into the inlet and allow the cells to settle for one minute. Observe the channel under 20X magnification. Press the Sine button and define a sine wave with an amplitude of two volts root mean square at a frequency of three megahertz.Press the Mod button to enable modulation. Press the Type option to change the wave mode into amplitude shift keying, or ASK. Set the modulation frequency to 250 megahertz, corresponding to a four-second loading/unloading period.Turn on the Output of the function generator and record a one-minute video every 10 minutes at 30 frames per second. The RBCs spontaneously responded to the electrical excitation by moving towards edges of electrodes with higher field strength. Under the on-keying phase, RBCs were stretched due to electrode deformation, while under the off-keying phase, RBCs were relaxed.When tracking individual RBCs during the one-hour fatigue testing, a gradual decrease in cellular deformation was observed.