This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

1. خلايا التثقيف على Micropost صالحة ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية لضمان العقم. وبالنظر إلى الكميات هنا هي لT25 قوارير زراعة الخلايا. هي الأمثل والمتوسطة وصفة وبذر خلية كثافة زراعة الخلايا للخطوط الخلايا السرطانية العظام HuO9 وM132. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثقافة خلية لزرع البذور على مجموعة micropost. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد نوعية ثقافة الخلية عن طريق وضع قارورة الثقافة على المجهر ضوء معيار. تأكد من أن الخلايا تظهر نمو نموذجي والتشكل من خلال تقدير كم من أسفل قارورة الثقافة وتغطيتها. A تغطية 70٪ -80٪ ​​تعكس معدل نمو صحي. إيلاء الاهتمام لكمية من الخلايا العائمة لأنها تمثل الخلايا الميتة و / أو ثقافة متضخمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا عن طريق إزالة المتوسطة وغسل 4 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) العازلة. إضافة 0.8 مل 1X التربسين / ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) واحتضان في RT حتى الخليةالصورة طرد، والتي تأخذ حوالي 2-4 دقائق. تحقق من هذه العملية مع المجهر وأحيانا الاستفادة من القارورة بلطف لدعم تهجير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل مستنبت الخلية (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) / F12 مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، 1٪ البنسلين / streptavidin (القلم / بكتيريا)) لوقف رد فعل ويغسل الخلايا المتبقية التي لا تزال الجلوس في أسفل القارورة. وفي وقت لاحق ماصة هذا التعليق صعودا وهبوطا عدة مرات للحصول على مزيج متجانس. تأكد من ماصة جميع الحلول في جميع أنحاء منطقة نمو الأصلية للقارورة لكسب تهجير فعال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية في لأنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي باستخدام أحد كبار الطرد المركزي في الجدول 0.5 x ج لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف واعادة تعليق بيليه خلية في 5 مل المتوسطة من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات. تأكد لتجنب توليد فقاعات أثناء القيام بذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كثافة الخلية باستخدام غرفة عد الخلايا وmicrosco خفيفةالمؤسسة العامة. تحقق من تعليق خلية في غرفة العد خلية لخلية المجاميع وضمان أن يكون الخلايا واحدة فقط للتجربة لاحقة. ماصة مرة أخرى صعودا وهبوطا عدة مرات إذا كانت الخلايا تميل الى تشكيل مجاميع للفصل بينهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تعليق الخلية مع متوسط ​​كافية للحصول على حل الخلية من 25000 خلية / مل. يخلط المزيج جيدا بواسطة أنبوب عكس مغلقة عدة مرات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجموعة micropost لزرع الخلايا. الحرجة ملاحظة: لا ماصة على مجموعة micropost مباشرة وهذا يحتمل أن تضر microposts، وخصوصا عندما يتم إدخال فقاعات غير المرغوب فيها. وعلاوة على ذلك، تأكد من أن مجموعة micropost أبدا يجف كما تحدث قوات الشعرية تؤدي إلى الانهيار من microposts. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الركيزة الزجاج مع مجموعة micropost مواجهة في بئر من لوحة 12-جيدا باستخدام زوج من ملاقط والرطب عن طريق إضافة 1 مل ايثانول (99٪). في احتضان RT لمدة 20-30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الإيثانولالتدرجي عن طريق إضافة حوالي 1 مل-المتأينة الماء المعقم (DI الماء) على الجانب جيدا والشفط ما يقرب من 1 مل باستخدام ماصة نقل أو الجهاز التنفسي. كرر هذه الخطوة 3 مرات على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال DI-الماء مع PBS العازلة بنفس الطريقة عن طريق إضافة والشفط حوالي 1 مل. كرر هذه الخطوة 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال PBS عازلة مع المتوسط ​​عن طريق إضافة والشفط حوالي 1 مل من المتوسط. كرر هذه الخطوة 3 مرات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الحل 1 مل الخلية (25000 الخلايا) على رأس كل مجموعة micropost المعدة. إغلاق لوحة متعددة جيدا وتحويلها إلى حاضنة (CO 2 5٪، 37 ° C). السماح للخلايا الالتزام وتنمو على رأس microposts لمدة 6 -7 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد عملية التصاق بعض الأحيان باستخدام ضوء المجهر. تحقق من أن معظم الخلايا تظهر انتشرت عبر microposts متعددة. </li></ol> 2. إصلاح وتلطيخ الخلايا ملاحظة: جميع الخطوات ووبالنظر إلى الكميات هنا هي لبئر واحدة من لوحة 12-جيدا. فمن المستحسن أن العملية لا يزيد عن أربعة من اثني عشر بئرا في وقت لتجنب جفاف الآبار بعد تطلع أي سائل، الأمر الذي سيؤدي في انهيار microposts. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من البئر وغسل خلايا 2X مع 1 مل PBS عازلة. للتأكد من تطبيق قوة لطيف في حين غسل مع PBS لإزالة الحطام الخلية التي تراكمت على مجموعة micropost أثناء الحضانة وفصل الخلايا الميتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا مع 0.5 مل 3.7٪ محلول الفورمالديهايد مخزنة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال حل الفورمالديهايد من قبل غسل 2X مجموعة micropost مع 1 مل من الماء DI العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الخلايا مع صبغة (0.05٪ Coomassie بريليانت الأزرق في الماء 50٪، 40٪ من الإيثانول وحمض الخليك 10٪) لمدة 90 ثانية. غسل حل تلطيخ الزائد 2X مع 1 مل من الماء DI العقيمة. إضافة 1 مل من الماء DI إلى micropost مجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق نتيجة تلطيخ باستخدام المجهر الضوئي. كرر رانه تلطيخ الخطوة، إذا خلايا الجسم هو خافت جدا بحيث لا يمكن تصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صفائف مخزن micropost مع الخلايا الملون على رأس القائمة في الثلاجة على 4 درجات مئوية. ضمان لإبقائهم تحت الماء في جميع الأوقات. </li></ol> التصوير 3. خلية ملاحظة: الخطوة 4 يطبق فقط على المجاهر دون اللانهاية تصحيح البصريات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل DI-المياه إلى طبق بيتري مع قاع زجاجي رقيق للالتصوير عالية الدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مجموعة micropost باستخدام زوج من الملقط في طبق التصوير مع microposts مواجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع التصوير طبق بتري على خشبة المسرح المنقولة من المجهر الضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل عصابة تعويض العدسة المستخدمة في التصوير حتى الرقم على نطاق ويمثل سمك الكلي لجميع المواد على طول مسار بصري للتعويض عن عدم تطابق في مؤشرات الانكسار الركيزة الزجاج، والمطاط الصناعي السيليكون والسائل على القمة. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى مظهر مشرق من micropostsالنوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق القزحية على الجانب الإضاءة وصولا الى 50٪ وإزالة أي حلقات المرحلة النقيض من مسار بصري تمكن من وضع مشرق الميدان العاديين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة مجموعة micropost أن microposts شكل خط أفقي عبر مجال المراقبة. تحديد نقطة البداية (على سبيل المثال، أعلى اليسار) ونقل طبق بيتري تدريجي عبر المرحلة مسح مجموعة micropost في حين أخذ العديد من الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ جميع الصور مع أعلى دقة الإعداد للكاميرا باستخدام الهدف 20X 40X أو. نهدف إلى أن خلية واحدة في وسط الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساح على طول محور Z من خلال الركيزة حتى نصائح micropost هي في التركيز. استخدام غرامة عجلة ضبط تركيز المجهر وتحويلها نحو التركيز على الجزء السفلي micropost لحوالي 2-3 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إجراء التصوير القياسية من خلال اتخاذ سلسلة من الصور اختبار واحد قسم مجموعة تجتاح المعلمات التصوير في وقت واحد (على سبيل المثال، وقت التعرض،وضع قزحية، إعدادات مصباح الخ). تحليل الصور مع MechProfiler وتحديد مجموعة المعلمة مناسبة لتحليل سريعة وموثوق بها. </li></ol> تحليل 4. صورة مع برامج المصدر المفتوح &quot;MechProfiler&quot; ملاحظة: يمكن تفعيل جميع وظائف البرنامج مع جهاز تأشير باستخدام زر الماوس الأيسر. ومع ذلك، فإن عامل المدربين استخدام مفاتيح الاختصار وثقت مصممة لتكون على النصف الأيسر من لوحة المفاتيح لتمكين باليدين معالجة الصور كفاءة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تحليل الصور برنامج MechProfiler وفتح مجموعة من الصور التي تحتاج إلى تحليل بالنقر على &quot;فتح&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج جميع المعلمات في قسم &quot;الإعدادات&quot; التي قدمها مطور برمجيات. تحديد المعايير التي يجب تكوين مخصص (أي عتبة كفاف والحد الأدنى من المسافة) وفقا للإجراءات وصفها بالتفصيل دليل البرامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل صورةالصورة واحدة تلو الأخرى من قبل الاقتصاص منهم لمجال الاهتمام باستخدام &quot;اقتصاص&quot; (انقر واسحب مع ضغط زر الماوس لأسفل). انقر مرتين داخل المستطيل رسمها لإنهاء هذا الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة كل مخطط الخلية مرئية واحدة من جانب واحد عن طريق النقر على &quot;رسم الخطوط العريضة خلية&quot; واستخدام المؤشر الشعر عبر عن الرسم بما في ذلك جميع microposts يتم إرفاق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل أي microposts غير المرغوب فيها بالنقر على &quot;تجاهل المشاركات&quot; واستخدام المؤشر الشعر عبر عن رسم. أرفق كل microposts التي تنتمي إلى خلية خارج القسم صورة أو التي تهرب لأي سبب آخر ولكن ليس من قبل خلية من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء برنامج فرعي &quot;البحث Centroids&quot; عن طريق النقر بالماوس. ضبط مرشح وضع بجوار زر &quot;البحث Centroids&quot; حتى يتم تسجيل جميع microposts، وهو أمر واضح من قبل الصليب الأحمر في مركزهم. إذا كان الإعداد المرشح هو أيضا سيتم تجاهل microposts منخفضة، وإذا كان مو عالية جداسيتم وضع علامة مواقف ltiple لmicropost واحد. الحفاظ على تصفية وضع ثابت خلال جلسة التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دليل وظيفة تحرير &quot;تحرير يدوي&quot; لcentroids مع مواقف micropost متعددة أو غاب. استخدام الماوس عبر الشعر لتحديد micropost في السؤال عن طريق النقر وسحبه عبر. انقر مرتين داخل المستطيل ووضع علامة حمراء في عداد المفقودين في قسم صورة الموسع، الذي يغلق تلقائيا. تجاهل مثل هذه micropost إذا كان خارج المخطط التفصيلي الخلية تعادل (راجع الخطوة 4.5) قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على شبكة micropost مثالية من خلال تفعيل &quot;إنشاء شبكة&quot; وظيفة مع النقر بالماوس. ضمان موقف يتوافق مع رئيس micropost صحيح، كما هو موضح من قبل عصابة زرقاء، داخل المخطط التفصيلي الخلية استخلاصها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصحيح أي صانع الشبكة في غير محله داخل منطقة الخلية حيث الحاجة باستخدام الدالة المناظرة &quot;مانويل تحرير&quot; مع النقر بالماوس. استخدام الشعر عبر لتحديد micropost في تشوestion عن طريق النقر وسحبه عبر. انقر مرتين داخل المستطيل الظهور ووضع علامة زرقاء المفقودة في القسم صورة الموسع، الذي يغلق تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم زر &quot;حساب الإمالات&quot; عن طريق النقر بالماوس للحصول على الرسم البياني للانحراف القيم محسوبة على أساس الفرق بين موقف وmicropost من داخل قسم صورة وشبكة مثالية ولدت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ تحليل كامل بما في ذلك جداول القيم عن طريق النقر بالماوس على &quot;حفظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة تحليل الصور إما عن طريق النقر على &quot;إعادة نظر&quot; وتحليل قسم آخر صورة أو النقر بالماوس على &quot;الصورة التالية&quot;، الذي مريح يمكن أن يتم ذلك باستخدام مفتاح القاذف لوحة المفاتيح الصحيح. </li></ol> 5. تحليل البيانات - Mechanoprofiling <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف &quot;results.xls&quot; مع برنامج جدول بيانات مكتب من المجلد الذي يحتوي على الصور التي تم تحليلها. أنه يحتوي على البيانات مع تنظيم القاعدةل القيم المحسوبة بما في ذلك جميع الانحرافات micropost والتدابير المشتقات القياسية مثل العمل (أي الطاقة الركيزة تشوه) من قبل خلية تحليلها. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, R. I., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+biomechanical+gradients+for+directed+bone+marrow+stromal+cell+differentiation+toward+tendon+and+bone.">Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone.</a> Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).</li><li>Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+and+biophysics+of+cancer+cells.">Biomechanics and biophysics of cancer cells.</a> Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).</li><li>Bartalena, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+adherent+single-cell+stiffness+in+tension:+design+and+testing+of+a+substrate-based+live+cell+functional+imaging+device.">A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device.</a> Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).</li><li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+Temperature+Operable+Autonomously+Moving+Bio-Microrobot+Powered+by+Insect+Dorsal+Vessel+Tissue.">Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue.</a> PloS ONE. 7 (7), (2012).</li><li>Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+retraction+of+bundled+type+IV+pili+enables+nanonewton+force+generation.">Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation.</a> Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).</li><li>Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Chemo-Mechanical+Effects+of+an+Anti-Cancer+Drug+Emodin+on+Breast+Cancer+Cells.">Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Cellular+Traction+Forces+by+Micropillar+Arrays:+Contribution+of+Substrate+Warping+to+Pillar+Deflection.">Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection.</a> Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Lemmon, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+for+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).</li><li>Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+subcellular+measurement+of+cell+stiffness+using+a+microengineered+stretchable+micropost+array+membrane.">Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane.</a> Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).</li><li>Roure, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+mapping+in+epithelial+cell+migration.">Force mapping in epithelial cell migration.</a> PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).</li><li>Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+of+material+surface+topography+and+wettability+on+cell-material+interactions.">Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions.</a> Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).</li><li>Badique, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+nuclear+deformation+on+micropillared+surfaces+by+substrate+geometry+and+cytoskeleton+organization.">Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization.</a> Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).</li><li>Sniadecki, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+microposts+as+an+approach+to+apply+forces+to+living+cells.">Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells.</a> PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).</li><li>Weng, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone-based+stretchable+micropost+array+membrane+for+monitoring+live-cell+subcellular+cytoskeletal+response.">A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response.</a> Lab Chip. 12, 731-740 (2012).</li><li>Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> J Vis Exp. (8), e311 (2007).</li><li>Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+stem+cell+mechanobiology+on+microfabricated+elastomeric+substrates+with+geometrically+modulated+rigidity.">Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity.</a> Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).</li><li>Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+in+Cell+Biology.">Micropatterning in Cell Biology.</a> Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).</li></ol>

The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

ويسعى هذا العمل للمضي قدما في مجال قوة الجر المجهري عن طريق خفض كبير الحواجز التقنية والعملية للدخول. هذه الحواجز تأتي من الجانبين. أولا وقبل كل شيء هي العديد من التحديات التقنية غير تافهة التي يجب التغلب عليها لتصنيع بتكاثر وتكليف مجموعة micropost تجريبيا. الثاني، هو ال?...

المقايسات خلية مقرها الحساسة والميكانيكية تسمح للتحقيق في الخلايا الملتصقة، مع مجموعة واسعة من التطبيقات التي تعكس الدور المحوري الذي يمكن أن تلعبه الميكانيكا في بيولوجيا الخلية. هذه التطبيقات غالبا ما تركز على الآليات الأساسية التي تقود عمليات التحت خلوية أو السلوك خلية كاملة. من جهة، يمكن أن العوامل البيئية الخارجية مثل اضافية تكوين مصفوفة الخلوية أو مصفوفة الصلابة تؤثر بشكل كبير على الاستجابة الميكانيكية والبيولوجية للخلية. 1 والشيء نفسه يمكن ملاحظتها بعد استخدام فئات كثيرة من المركبات النشطة صيدليا، وآثار والتي هي غالبا ما تتميز باستخدام نماذج ثقافة الخلية. 2 وفي غيرها من الخصائص الوراثية اليد، مثل تلك التي تسببها طفرات جينية عفوية أو تجريبيا يسببها، ويمكن أن تحدث تغيرات ملحوظة في النمط الظاهري الخلية التي ترتبط مع التغيرات في بنية الهيكل الخلوي وظيفة. 3 هذه الأمثلة ل فقط عدد قليل من كثير ممكنالموضوعات التي phenotyping الميكانيكي للخلايا هو ذات الصلة، وجرى التحقيق مع كل هذه مفيدة مع المصفوفات micropost. وفي وقت كتابة هذا التقرير، تم نشر ما يقرب من 200 المقالات التي تصف التفاعل خلية micropost. هذه الأعمال مناقشة الجوانب النظرية للمبادئ انحراف micropost وكذلك الإرشادات العملية على صنعها. تم نشر المقالة الأولى التي تصف التفاعل بين الخلايا والمصفوفات micropost مرنة تان وزملاؤه في عام 2003. 4 وعلى النقيض من الكلاسيكية المجهري قوة الجر (TFM) حيث تستخدم ركائز لينة مستمرة لتقدير انقباض الخلايا nanonewton النطاق، تان وآخرون. وصف طريقة استخدام عدة عوارض رأسية متباعدة عن كثب مصنوعة من السيليكون والمطاط الصناعي. المزايا الرئيسية لهذه التقنية الخروج من اثنين من السمات الرئيسية. أولا من أجل تغيير خلايا واضحة الركيزة صلابة واحد يحتاج فقط إلى تغيير أبعاد micropost مع الحفاظتكوين الركيزة خلاف مستمر وبالتالي تجنب الاختلافات في طوبولوجيا السطحية والكيمياء. microposts الثانية تتصرف مثل الينابيع الفردية التي يمكن تحليلها بتحفظ مع قوة ودقة مكانية بناء على أمر من الالتصاقات البؤرية الفردية ويمكن أن تقلل من التحديات التحليلية التي هي ملازمة لتحليل مماثل من قبل ستاندرد TFM. اليوم مجموعة من التطبيقات للصفائف micropost يتجاوز بكثير مجرد رسم الخرائط من القوات لبضع خلايا مفردة. على سبيل المثال، أكياما تقارير استخدام من الأنسجة سفينة ظهري معزولة عن يرقة العث بمثابة المحرك للمجموعة micropost، من أجل وضع الحشرات التي تعمل بالطاقة العضلية مستقلة الصغرى الروبوت. 5 ومع ذلك، فقد ركزت معظم التطبيقات المنشورة microposts على دراسات الحالات الطبية مثل العدوى أو السرطان. على سبيل المثال، تم استخدام المصفوفات micropost لدراسة توليد قوة المجمعة النوع الرابع الشعرة لبكتيريا gonorrhالمستعمرات أويا مقترن شلالات إشارة المعززة للعدوى. وقد استخدمت 6 آخرون microposts لدراسة خلايا سرطان الثدي تعامل مع المركبات الدوائية استهداف الهيكل الخلوي. 7 غالبا ما يوصف انحراف لmicropost باستخدام نظرية الكلاسيكية شعاع لناتئ مع نهاية الحمل على افتراض الخلية تعلق فقط على الحافة جدا من micropost. هنا F القوة المطبقة التي تسبب δ انحراف يعتمد على micropost في &quot;الانحناء صلابة&quot; ك ويحسب عن طريق: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) مع E، I، وL يجري معامل يونغ، لحظة مجال الجمود وشعاع طول التوالي. ومع ذلك، النتائج من هذه المعادلة تعطي سوى تقريب العام للقوات في العمل منذ شعاع القص والثني وكذلك لا تؤخذ تزييفها الركيزة في ميلانالعد. وبالنظر إلى أن microposts تكون عادة مصنوعة من مواد لينة مثل polydimethylsiloxane (PDMS) المستندة مطاط السيليكون تحتاج هذه العوامل التي ينبغي إدراجها. . شوين آخرون أثبتت أن هناك مثل هذا عامل التصحيح بناء على نسبة العرض إلى الارتفاع micropost (L / D) والبوليمر المقابلة للنسبة بواسون ضد 8 وتعطى من قبل: <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) مع الميل T (ت) أن يكون معامل إمالة يتضمن كما يمكن العثور عليها في المادة نفسها المناسب المعلمة = 1.3: <img alt="المعادلة 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) وهذا يعني صلابة وmicropost لتصحيح ك المراسل هو نتاج خالص الانحناء صلابة ك = ك الانحناء ومعامل التصحيح نيوسقدمها: <img alt="المعادلة 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) لذلك، يجب أن يتم تنفيذ العمليات الحسابية قوة الخلية باستخدام الاختلاف أكثر دقة من المعادلة (1) القراءة الآن: <img alt="المعادلة 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) تأثير التصحيح يصبح أكثر وضوحا في أقرب وقت يتم استخدام القيم النموذجية لأبعاد micropost. على سبيل المثال، micropost 15 ميكرون طويل مع المقطع العرضي دائري وقطره 5 ميكرومتر المصنوعة من المطاط سيليكون القائمة على PDMS-يؤدي إلى معامل التصحيح 0.77 وبالتالي على حساب غير المصححة أن المبالغة قوات خلية المبذولة بنسبة 23٪. هذا يصبح أكثر حدة لmicroposts مع نسب أصغر. تقليديا، كما تم على أساس micropost تحليل الصورة على شعاع المثالي نظرية الانحناء. في عام 2005 المجموعة التي كانت رائدة في استخدام ميكرصفائف opost نشرت برمجيات تحليل صورة مناسبة لتحليل micropost 9 البرنامج يتطلب ترخيص البرمجيات ويجب على المستخدم أن تأخذ ثلاث صور لكل موقف؛ واحد من كل من أعلى وأسفل طائرات micropost في اسطة نقل واحدة أخرى في وضع مضان مع الخلية الملون. بعد مقارنة المناصب العليا والسفلي لكل micropost البرنامج يحدد حقل القوة ناقلات ويحسب المعلمات ذات الصلة مثل قوة لكل وظيفة. وجود حزم البرامج الأخرى وذكرت المبادئ تحليلهم لفترة وجيزة في المواد ذات الصلة التي تصف لهم، ولكن هذه حزم البرامج التحليلية هي عموما ليست متاحة للجمهور. 10،11 ويمكن تصنيف صفائف micropost مصممة للقوات خلية رسم الخرائط إما يجري في تخطيط micropost متعامد أو أحد سداسية، وهذه الأخيرة التي لديها ميزة الثغرات مسافة واحدة بين جميع microposts الجار. microposts نموذجية هكتارلقد مقطع عرضي دائري وأبعادها تتراوح من 1.0 ميكرون إلى 10 ميكرون في القطر و2-50 ميكرون في الطول. 4 ومع ذلك، كما تم الإبلاغ عن microposts مع المقطع العرضي بيضاوي الشكل أو مربع. 12،13 استخدام مخاليط سيليكون استنادا PDMS-كمادة micropost يسمح لإضافة النانوية إلى الخليط. على سبيل المثال إضافة الكوبالت النانو قضبان تمكن التنشيط المغناطيسي للmicropost وبالتالي يعطي آخر درجة من الحرية للتصاميم تجريبية المحتملة. 14 معظم الجماعات تنتج صفائف micropost على ركائز صلبة مسطحة مثل غطاء زجاجي أو داخل طبق بتري. ومع ذلك، ذكرت مان وزملاء العمل مؤخرا مجموعة micropost شكلت على غشاء لمط 15 يسمح هذا التطبيق من خلية القوات تمتد إلى الخلايا الملتصقة أثناء دراسته يعيش خلايا التحت خلوية الردود ديناميكية من حيث انقباض الخلايا. العاملين على نطاق واسع، ومعظم إنشوتستند عملية أسسنا لجعل صفائف micropost على الطباعة الحجرية الناعمة كما هو موضح في البروتوكولات الثاقبة من Sniadecki والزملاء. 16-18 في عمليات غرف الأبحاث قياسية قصيرة وتستخدم لتوليد المجهرية على رأس رقاقة السيليكون باستخدام مقاومة للضوء SU8. ويلي ذلك عملية النسخ حيث يلقي المطاط سيليكون على هياكل نقلها إلى قوالب. في الخطوة الثانية وتستخدم هذه القوالب لتكرار المجهرية الأولية باستخدام المطاط سيليكون على رأس الركيزة المختار. ولكن على الرغم من العدد الكبير والمتزايد من المنشورات المتعلقة تطبيقها، وإنشاء عملية التصنيع لmicroposts يأخذ قدرا كبيرا من الوقت حتى لخبراء الهندسة الدقيقة. هناك العديد من الخطوات العملية التي تتطلب التحسين والتكيف مع بيئة معملية محددة وتخطيط micropost أن يؤديا إلى مستوى جودة مقبول. صفائف micropost التجارية متوفرة الآن في استعداد رس استخدام (&quot;خارج على الرف&quot;) تنسيق مع جودة عالية على الدوام. على هذا النحو فهي بديل لعملية التصنيع المعقدة والطويلة اللازمة لإنتاج في الموقع. في هذه الورقة تم استخدام مجموعة micropost المتاحة تجاريا لرسم خرائط القوات الخلوية باستخدام مشرق الميدان صورة واحدة المجهري. الأهم توضح هذه المادة ويوثق تماما وظيفية برمجيات المصدر المفتوح اسمه MechProfiler، والذي يتوفر للتحميل كمادة تكميلية لهذه المخطوطة. نسخة الحفاظ بنشاط من البرنامج يمكن أيضا الاطلاع على http://www.orthobiomech.ethz.ch. مزيج من &quot;حاضرة&quot; فحص وتحليل البرمجيات مفتوحة المصدر متوافق يخفض بشكل ملحوظ العقبة دخول إلى تحقيق تجارب TFM دقيقة. يمكن للباحثين من دون الوصول إلى أي مرافق غرفة نظيفة أو الخبرة لتطوير البرمجيات تحليل قوات الخلوية بنجاح. انها تمكن المستخدم من التركيز على mechanosensitivity الناتج الفحص بدلا من التكنولوجيا في حد ذاتها، ويجعل قياسات قوة الجر المتاحة للمجتمع الأوسع. وعلاوة على ذلك، وهذا هو خطوة هامة لتمهيد الطريق نحو الفحص التلقائي بالكامل من صفائف micropost. برامج التحليل MechProfiler بمعالجة الصور في ملف تنسيق TIFF، PNG، BMP و JPG. يمكن أن تؤخذ الصور باستخدام مضان، الطوري أو مشرق الميدان المجهر الضوئي. تشغيل برنامج مستقل مع حرية ماتلاب مترجم وقت التشغيل (متوفر على العنوان التالي: الشكل 12) والخوارزميات الكامنة تسمح لمعالجة الصور مبسط، والتي تمكن المستخدم من معالجة الصور مع الخلايا وحيدة أو متعددة في حوالي 1 دقيقة. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا قد تكون إما يعيشون أو &quot;ثابتة&quot;. برنامج MechProfiler قادر على زيادة كبيرة في تحليل البيانات الإنتاجية من خلال الاعتماد على استنساخ صفائف micropost التجاري الجودة، وبشكل أكثر تحديدا، الافتراضي &amp; #8220؛ غير نحيد &quot;موقف كل وظيفة في مجموعة يمكن افتراض ضد شبكة مثالية (الانحرافات التصنيع للحصول على الشبكة في صفائف المستخدمة في هذه الدراسة كانت أقل من 100 نانومتر). في واحد قصير يفتح مجموعة مختارة من ملفات الصور لتحليل والمحاصيل منهم إلى المنطقة من الفائدة، ويحدد المشاركات التي كتبها مغطاة بخلايا أو التي تحتاج إلى التخلص منها، ويحدد المواقف آخر، وحساب الانحرافات / القوات ضد الشبكة المثالية، وأخيرا يوفر جميع البيانات خلية محددة مع وجود إمكانية للتصدير، بما في ذلك جدول المكتبية العادية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS-buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropost array&#160;</td>
			<td rowspan="2">MicroDuits</td>
			<td rowspan="2">MPA-col1/FN</td>
			<td>Micropost dimensions:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td>
			<td>&#216;= 6.4 &#181;m, l=18.2 &#181;m; grid=&#160;13 &#181;m, kcorr= 2.87 nN/&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100.983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td>Coomassie blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol ACS p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>WillCo Wells BV</td>
			<td>GWSb-3522</td>
			<td>35 mm diameter, aperture 22&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-100 Eclipse</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3-L3</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Camera controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS Fi2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

والميزة الرئيسية لهذه التقنية وصفها تكمن في بساطته وإمكانية الاندماج السريع والفعال في العمل في المعمل الروتيني. مزيج من جودة عالية صفائف استشعار التجارية يقترن برمجيات المصدر المفتوح يوفر معلومات حول والميكانيكية الحساسية التي من شأنها أن تتطلب خلاف ذلك إمكانية ?...

Watch this Scientific Journal Video about Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays at JoVE.com

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

سهلة ودقيقة والميكانيكية التنميط على Micropost صالحة

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.0K Views.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

Video: Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

دراسة مسارات المتداول على أنماط الخلية المستقبلة المتناظر

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., global gene expression, cell division) encountered within living cells. However, such systems, used in conventional macro-scale bulk reactors, often fail to exhibit the dynamic behaviors and efficiencies characteristic of their living micro-scale counterparts. Understanding the impact of internal cell structure and scale on reaction dynamics is crucial to understanding complex gene networks. Here we report a microfabricated device that confines cell-free reactions in cellular scale volumes while allowing flexible characterization of the enclosed molecular system. This multilayered poly(dimethylsiloxane) (PDMS) device contains femtoliter-scale reaction chambers on an elastomeric membrane which can be actuated (open and closed). When actuated, the chambers confine Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reactions expressing a fluorescent protein, allowing for the visualization of the reaction kinetics over time using time-lapse fluorescent microscopy. Here we demonstrate how this device may be used to measure the noise structure of CFPS reactions in a manner that is directly analogous to those used to characterize cellular systems, thereby enabling the use of noise biology techniques used in cellular systems to characterize CFPS gene circuits and their interactions with the cell-free environment.

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

صالحة قابل للغلق غرفة فيمتولتر مجانا خلية علم الأحياء

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

ميكروفلويديكس التواصل مع صفائف ميكروليكترودي لدراسة الاتصالات العصبية ونشر إشارة محواري

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

شبكات خلايا القلب المستمدة من iPSC البشرية على صفائف متعدد الأقطاب الكهربائية الصغيرة للتسجيلات المحتملة للعمل المتكرر

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

تلفيق Ti3C2 MXene Microelectrode صفائف في فيفو التسجيل العصبي

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لتحليل الوظيفة المناعية لأنسجة الزرع المشرحة

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

تصنيع صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية 3D باستخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية ، والخلايا الليفية القلبية ، والخلايا البطانية

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...