تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82204951) وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2020JDRC0102).

تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6 (6 أسابيع من العمر ، 25-30 جم) في هذه الدراسة. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للوائح المحلية لرعاية وأخلاقيات التجارب. تمت الموافقة على الدراسة من قبل مستشفى غرب الصين التابع للجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية بجامعة سيتشوان.
1. وضع العلامات الكبيبات وإعداد الأنسجة
<ol><li>وضع العلامات الكبيبات<ol><li>قم بإذابة FITC-dextran (10 مجم) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 1: 1 (1 مجم: 1 مل) لتحضير محلول مسبار العمل. ملاحظة: يمكن تخزين حل العمل في 4 °C لمدة 1 شهر.</li>
		<li>ضع الماوس C57 في مثبت وريد ذيل الماوس. بلل الشاش بالماء الساخن ، لف الشاش حول الجزء الأوسط من ذيل الماوس ، وقم بتسخين الذيل لمدة 1 دقيقة.</li>
		<li>امسح ذيل الماوس بنسبة 75٪ من الإيثانول حتى تظهر عروق الذيل اليمنى واليسرى.</li>
		<li>ارسم 100 ميكرولتر من محلول مسبار العمل باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل وقم بحقن المحلول ببطء في وريد ذيل الفأر.</li>
		<li>بعد الحقن ، دع محلول المسبار يدور لمدة 30 دقيقة. السماح للفئران بالتحرك بحرية في أقفاصها.</li>
		<li>بمجرد تحقيق الدورة الدموية الكافية ، قم بتخدير الفئران بعمق عن طريق الحقن داخل الصفاق لبنتوباربيتال الصوديوم (1٪ ، 60-80 ميكروغرام / كجم).</li>
	</ol></li>
	<li>أخذ عينات الكلى وتثبيتها<ol><li>ثبت الفئران المخدرة على اللوحة التشريحية في وضع ضعيف. تأمين الكفوف مع الشريط الطبي.</li>
		<li>بعد تحضير الجلد ، القتل الرحيم للفئران بجرعة مميتة من بنتوباربيتال الصوديوم (1٪ ، 10 مجم / كجم).</li>
		<li>قم بعمل شق في منتصف البطن لكشف تجويف البطن.</li>
		<li>كشف الكلى وإزالتها بمشرط ومقص في غطاء الدخان. قم بإزالة الغلاف الكلوي برفق.</li>
		<li>اجمع الكلى وثبتها في 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.</li>
		<li>اغسل العينات باستخدام PBS ثلاث مرات 1 ساعة لكل منها مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
		<li>تحضير الكلى للفحص المجهري.<ol><li>شريحة الكلى للفحص المجهري متحد البؤر: قطع الكلى إلى شرائح بسمك 1 مم باستخدام مصفوفة الدماغ (1 مم فولاذ ، 40-75 جم) لتوحيد سمك الشريحة. انقل الشرائح إلى 4٪ PFA واستمر في التثبيت عند 4 درجات مئوية طوال الليل.</li>
			<li>الكلى الكاملة للفحص المجهري للصفائح الخفيفة: ثبت الكلى في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. المقاصة
<ol><li>إعداد الكاشف<ol><li>تحضير كاشف CUBIC-L عن طريق خلط 10٪ (بالوزن / الوزن) N-butyldiethanolamine ، 10٪ (بالوزن / الوزن) Triton X-100 و 80٪ ddH2O.</li>
		<li>تحضير كاشف CUBIC-R عن طريق خلط 45٪ (بالوزن / الوزن) مضاد للحرارة ، 30٪ (بالوزن / الوزن) نيكوتيناميد ، 0.5٪ (حجم / حجم) N-butyldiethanolamine و 24.5٪ ddH2O. تأكد من أن المحلول يحتوي على درجة حموضة 9.6-9.8 ومعامل انكسار (RI) يبلغ 1.522. ملاحظة: يستخدم CUBIC-L لإزالة الدهون ، ويستخدم CUBIC-R لمطابقة معامل الانكسار.</li>
	</ol></li>
	<li>إجراءات المقاصة<ol><li>اجمع عينات الكلى في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ثم قم بمسحها في CUBIC-L مع الاهتزاز عند 60 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. استبدل CUBIC-L كل 4 ساعات (لشرائح الكلى) أو كل 24 ساعة (لكلية كاملة) حتى تحقيق شفافية بصرية مرضية. ملاحظة: تستغرق هذه العملية 1 يوم لشرائح الكلى و 5 أيام لكلية كاملة.</li>
		<li>اغسل العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني مع اهتزاز لطيف في RT لمدة 1 ساعة لكل منهما.</li>
		<li>ضع CUBIC-R على العينات ، مع هز العينات عند 37 درجة مئوية ، 60 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات.</li>
		<li>مراقبة العينات التي تم تطهيرها مباشرة أو تخزينها في أنابيب سوداء مملوءة ب CUBIC-R في RT لمدة 1 أسبوع.</li>
	</ol></li>
</ol>3. الحصول على الصور
<ol><li>التصوير البؤري ملاحظة: صور عينات الكلى المقطعة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر (العدسات: هدف Plan Apo λ 4× / 0.2 N1 أو هدف Plan Apo VC 10× / 0.45 DIC N1). التقط صورا كبيرة (على سبيل المثال ، 6052 ميكرومتر × 6052 ميكرومتر لشريحة الكلى) باستخدام مكدسات z.<ol><li>قم بتشغيل المجهر متحد البؤر بالتسلسل التالي: طاقة الليزر ، مفتاح التحكم متحد البؤر ، الكمبيوتر ، المجهر ، والأجهزة متحدة البؤر. بعد إجراء الاختبار الذاتي ، قم بتشغيل البرنامج البؤري.</li>
		<li>حدد العدسة المناسبة. قم بإزالة العينة من كاشف CUBIC-R ، وضعها في الطبق متحد البؤر ، وقم بتغطيتها لمنع كاشف CUBIC-R من الجفاف.</li>
		<li>انقل العينة إلى منتصف مجال الرؤية واضبط المستوى البؤري حتى يتم التركيز عليه.</li>
		<li>تطبيق إعادة البناء ثلاثية الأبعاد (الخطوة 3.1.4.1) وإعادة بناء الصورة الكبيرة (الخطوات 3.1.4.2-3.1.4.3).<ol><li>إعادة بناء 3D (متحد التركيز): قم بتبديل مستوى التكبير في اتجاه واحد حتى لا يكون هناك مضان مرئي ؛ يتم تعريف هذا الموقف على أنه الجزء العلوي. بعد ذلك ، قم بتبديل مستوى التكبير / التصغير في الاتجاه المعاكس حتى لا يظهر أي مضان ؛ يتم تعريف هذا الموقف على أنه القاع. انقر فوق الزر "تشغيل " في الزاوية السفلية اليمنى من مربع الحوار لبدء المسح.</li>
			<li>إعادة بناء الصورة الكبيرة (متحدة التركيز): انقل مجال الرؤية إلى منتصف العينة، وقم بتعيين الموضع الحالي كمركز. حدد حقل عرض 2 × 2.</li>
			<li>في واجهة ND متعددة الوظائف، حدد مكدس Z لإعادة بناء الصور الكبيرة وتعيين خيارات مختلفة في اللوحة. ثم اضغط على يجري butto n لبدء المسح.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>التصوير المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) ملاحظة: تخيل الكلى بأكملها باستخدام مجهر مضان بورقة ضوئية (العدسة: EC Plan-Neofluar 5x / 0.16 (متوسط n = 1.529) الهدف).<ol><li>إرفاق العينة (LSFM):<ol><li>قم بلصق الكلية الشفافة بمحول تثبيت العينة وانتظر حتى يتم ربط الكلية بإحكام.</li>
			<li>انقع الكلى في صندوق العينات وادفع حاوية العينة إلى نظام المجهر. أغلق الفتحة.</li>
		</ol></li>
		<li>المراقبة والمسح الضوئي (LSFM):<ol><li>في واجهة تحديد الموقع ، انقل العينة إلى موضع مراقبة مناسب. قم بالتبديل إلى واجهة الاستحواذ ، واضبط المسار البصري ، وحدد ليزر 488 نانومتر ، LBF 405/488/561/640 ، كتلة مرشح التقسيم البصري SBS LP 490 ، حدد الكاميرا 2 ، وقم بتغيير اللون الزائف إلى اللون الأخضر.</li>
			<li>املأ قيمة إزاحة Z اليسرى/اليمنى المسجلة سابقا في القائمة الفرعية للقناة . حدد أصغر تكبير/تصغير (0.36) وقم بضبطه للحصول على أقصى قدر من الوضوح.</li>
		</ol></li>
		<li>أوجد حد X\Y والنطاق Z للعضو بأكمله. اضبط شدة الليزر ووقت التعرض (يفضل أن يكون أقل من 10 مللي ثانية) ، وانقر فوق تشغيل للبدء.</li>
		<li>إذا كان النسيج كبيرا جدا ، فقم بدمج صورتين أو أكثر مع خياطة الصورة. افتح الملف الذي تم التقاطه باستخدام برنامج الفحص المجهري (هنا ، ZEISS ZEN 3.7). حدد المعالجة > الطريقة > خياطة معلمة > الطريقة > تطبيق لإكمال خياطة الصورة.</li>
	</ol></li>
</ol>4. معالجة البيانات والقياس الكمي
ملاحظة: قم بمعالجة مكدسات الصور باستخدام برنامج Imaris (تحليل الصور) ، باستخدام وظيفة Surface لتسمية الكبيبات وإجراء التحليل.
<ol><li>عدد الكبيبات<ol><li>استيراد الصور الكبيرة (الفحص المجهري متحد البؤر) أو الصور المخيطة (الفحص المجهري للصفائح الضوئية) إلى برنامج تحليل الصور.</li>
		<li>افتح الملفات في برنامج تحليل الصور. انقر فوق الزر Surface لإنشاء جهاز Surface جديد. اتبع الدليل الموجود في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة.<ol><li>انقر فوق الزر التالي (زر السهم الأيمن) دون تحديد أي شيء.</li>
			<li>ضع علامة في المربع قبل خيار Smooth وأدخل رقما مناسبا (على سبيل المثال ، 14.5) للتحكم في تفاصيل Surface. حدد طرح الخلفية في العتبة واملأ المربع بمتوسط القطر التقريبي للكبيبات. انقر فوق الزر التالي .</li>
			<li>اضبط إذا لزم الأمر ، وانقر فوق الزر "التالي ". حدد النطاق المناسب وانقر فوق الزر التالي لإنشاء Surface.</li>
		</ol></li>
		<li>انقر فوق تصفية ، ثم إضافة زر لإضافة كروية لتصفية الكائنات غير الكروية. انقر فوق الزر تكرار لنسخ هذا السطح الجديد.</li>
		<li>انقر فوق الزر "إحصائيات " ، ثم انقر فوق الزر "عام " ؛ سيقدم البرنامج عدد الكبيبات على أنه العدد الإجمالي للسطح.</li>
	</ol></li>
	<li>حجم الكبيبات<ol><li>إنشاء سطح الكبيبات على النحو الوارد أعلاه.</li>
		<li>عند اكتمال Surface، انقر زر التحديد لتحديد الكائنات المستهدفة وتقديم حجم كل كائن. انقر فوق الزر حفظ ، وقم بتصدير الإحصائيات إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.</li>
	</ol></li>
	<li>حجم الشريحة أو الكلية الكاملة<ol><li>استيراد الصور الكبيرة (الفحص المجهري متحد البؤر) أو الصور المخيطة (الفحص المجهري للصفائح الضوئية) إلى برنامج تحليل الصور.</li>
		<li>افتح الملفات في برنامج تحليل الصور. انقر فوق الزر Surface لإنشاء جهاز Surface جديد. اتبع الدليل الموجود في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة.<ol><li>انقر فوق الزر التالي (زر السهم الأيمن) دون تحديد.</li>
			<li>ضع علامة في المربع قبل خيار Smooth وأدخل رقما مناسبا (على سبيل المثال، 50) للتحكم في تفاصيل Surface. حدد الكثافة المطلقة في العتبة. انقر فوق الزر التالي .</li>
			<li>اضبط Surface حتى يغطي الأنسجة بالكامل، وانقر فوق الزر التالي . انقر فوق الزر التالي لإنشاء Surface.</li>
		</ol></li>
		<li>انقر فوق الزر تحديد لتحديد سطح النسيج بأكمله وتقديم حجم النسيج. انقر على الزر حفظ لتصدير الإحصاءات إلى جدول بيانات.</li>
	</ol></li>
</ol>

وضع العلامات الفلورية للكبيبات في كليتي الفأر التي تم تطهيرها للفحص المجهري

<ol>
	<li>Hoy, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+number,+glomerular+volume,+renal+disease+and+hypertension.">Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).</li><li>Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nephron+number:+implications+for+health+and+disease.">Human nephron number: implications for health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).</li><li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age,+kidney+weight,+and+body+surface+in+normal+man.">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).</li><li>Rasch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+diabetic+glomerulopathy+in+streptozotocin+diabetic+rats+by+insulin+treatment.+Kidney+size+and+glomerular+volume.">Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume.</a> Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+number+and+size+variability+and+risk+for+kidney+disease.">Glomerular number and size variability and risk for kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).</li><li>Bertram, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+and+how+we+determine+nephron+number.">Why and how we determine nephron number.</a> Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).</li><li>Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+numbers+of+glomeruli+and+individual+glomerular+cell+types+in+the+normal+rat+kidney.">Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+renal+glomeruli+with+the+new+stereology.">Analyzing renal glomeruli with the new stereology.</a> International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).</li><li>L&#248;drup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+biopsies+can+be+used+for+estimations+of+glomerular+number+and+volume:+a+pig+study.">Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study.</a> Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).</li><li>Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+glomerular+volume:+a+comparison+of+four+methods.">Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods.</a> Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).</li><li>Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurements+of+kidney+glomerular+number+and+size+in+healthy+and+Os(/+)+mice+using+MRI.">In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cationic+near+infrared+fluorescent+agent+and+ethyl-cinnamate+tissue+clearing+protocol+for+vascular+staining+and+imaging.">A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).</li><li>Beeman, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+glomerular+number+and+size+in+perfused+kidneys+using+MRI.">Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).</li><li>Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+glomerular+number+in+situ+using+magnetic+resonance+imaging+and+biopsy.">Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy.</a> Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).</li><li>Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+molecular+imaging+of+the+kidney.">Label-free molecular imaging of the kidney.</a> Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).</li><li>Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+thick+and+thin+section+method+for+estimation+of+podocyte+number,+glomerular+volume,+and+glomerular+volume+per+podocyte+in+rat+kidney+with+Wilms'+tumor-1+protein+used+as+a+podocyte+nuclear+marker.">Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Lloyd-Lewis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mammary+gland+and+mammary+tumours+in+3D:+optical+tissue+clearing+and+immunofluorescence+methods.">Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC-plus:+An+optimized+method+for+rapid+tissue+clearing+and+decolorization.">CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+combinations+of+fluorescent+vessel+labeling+and+tissue+clearing+methods+for+three-dimensional+visualization+of+vasculature.">Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature.</a> Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Bai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+vascular+network+labeling+method+for+transparent+tissues+of+mice.">A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice.</a> Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kolesov&#225;, H., Olejn&#237;&#269;kov&#225;, V., Kvasilov&#225;, A., Gregorovi&#269;ov&#225;, M., Sedmera, D. J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+imaging+methods+for+cardiovascular+development.">Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development.</a> Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLARITY-based+tissue+clearing+and+imaging.">Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging.</a> Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).</li><li>Ert&#252;rk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).</li></ol>

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

يمكن تصنيف تقنيات إزالة الأنسجة إلى 3 أو 4 مجموعات29،30،31. تم تطبيق إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات العضوية (على سبيل المثال ، DISCO و PEGASOS) ، وتنظيف الأنسجة المائية (على سبيل المثال ، CUBIC) ، وتطهير الأنسجة بتضمين الهيدروجيل (على سبيل المثال ، ...

عدد وحجم الكبيبات مهمة جدا لتشخيص وعلاج أمراض الكلى المختلفة1،2،3،4،5. المعيار الذهبي لتقدير عدد الكبيبات هو تركيبة التشريح المادي / المجزأ. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة كواشف ومعدات خاصة ، مما يجعلها بطيئة ومكلفة6،7،8،9. توفر الخزعة ثروة من المعلومات ، ولكن من الواضح أن هذه الطريقة مناسبة فقط للتقديرات التقريبية10,11. كما تستخدم تقنيات التصوير الطبي ، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي المحوسب (CT) والأشعة السينية ، على نطاق واسع في الكشف عن الكبيبات12،13،14،15 ، ولكن هذه التقنيات تتطلب أدوات ضخمة. كما استخدمت طرق جديدة ، مثل مطياف الكتلة التصويري16 للتصوير بالامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) أو طريقة المقطعالسميك والرقيق 17 ، في الكشف عن الكبيبات ، على الرغم من أنها لا تزال مملة وشاقة.
بمساعدة تقنيات الشفافية ، من الممكن مراقبة أعماق أعمق والحصول على معلومات أكثر ثراء واكتمالا من الأنسجة السميكة أو حتى الأعضاء الكاملة18،19،20،21،22،23. لذلك ، تم استخدام تقنيات الشفافية على نطاق واسع في أبحاث الكلى24. وتشارك أيضا مراقبة والكشف عن الكبيبات في الكلى تطهيرها. ومع ذلك ، فإن هذه المقالات المنشورة إما أشارت لفترة وجيزة فقط إلى الكشف عن الكبيبات25 أو استخدمت طرق وضع العلامات التي يصعب تحقيقها مثل المعدلة وراثيا26 ، أو الأصباغ المنتجة ذاتيا13 ، أو حضانة الأجسام المضادة عالية التركيز27 لتسمية الكبيبات. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الدراسات قد حللت الكبيبات في الكلى التي تم تطهيرها ، إلا أن التحليلات كانت دائما محدودة13 أو اعتمدت على خوارزميات التحليل التي أنشأها المؤلفون أنفسهم26.
لقد أظهرنا سابقا طريقة أكثر ملاءمة لتسمية الكبيبات في كلى الفئران28. باستخدام Imaris ، وجدنا أنه يمكن الحصول بسرعة على عدد الكبيبات وتكرارها وحجمها. وبالتالي ، نقدم هنا مجموعة من الطرق التي يسهل الوصول إليها وشمولية ومبسطة لتسمية وتحليل كبيبات كلى الفئران.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>7007171800</td>
			<td>Fixation reaagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>502 Glue&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>7146</td>
			<td>For fixing the kidney to the sample fixing adapter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipyrine</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A110660</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Matrix</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>1mm 40-75</td>
			<td>Tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1plus</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD150S</td>
			<td>Labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet fluorescence microscopy&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Light sheet 7&#160;</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Ensiweier</td>
			<td></td>
			<td>Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25&#8211;30 g)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Butyldiethanolamine</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>B299095</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>N105042</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Natriumsalz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail vein fixator</td>
			<td>JINUOTAI</td>
			<td>JNT-FS35</td>
			<td>Fix the mouse for vail injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and fast method for labeling and analyzing mouse glomeruli

الكبيبات هي وحدات أساسية في الكلى. ومن ثم ، فإن دراسة الكبيبات أمر محوري لفهم وظائف الكلى وعلم الأمراض. يوفر التصوير البيولوجي معلومات بديهية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان تسمية الكبيبات ومراقبتها. ومع ذلك ، فإن طرق مراقبة الكبيبات المستخدمة حاليا تتطلب عمليات معقدة ، وقد تفقد النتائج تفاصيل التسمية أو المعلومات ثلاثية الأبعاد (3D). تم استخدام كوكتيلات تصوير الدماغ الواضحة والخالية من العوائق وتقنية مسح الأنسجة بالتحليل الحسابي (CUBIC) على نطاق واسع في أبحاث الكلى ، مما يسمح باكتشاف أكثر دقة وعمق اكتشاف أعمق. وجدنا أنه يمكن تمييز كبيبات الفئران بسرعة وفعالية عن طريق حقن الوريد الذيل للوزن الجزيئي المتوسط FITC-Dextran متبوعا بطريقة المقاصة المكعبة. يمكن مسح كلية الفأر التي تم تطهيرها بواسطة مجهر ضوئي (أو مجهر متحد البؤر عند تقطيعها) للحصول على أكوام صور ثلاثية الأبعاد لجميع الكبيبات في الكلية بأكملها. يمكن بسهولة رقمنة إشارات الكبيبات وتحليلها لقياس عدد الكبيبات وحجمها وتواترها.

The number and volume of glomeruli are very important for the diagnosis and treatment of various kidney diseases1,2,3,4,5. The golden standard of glomeruli number estimation is the physical dissector/fractionator combination. However, this method requires special reagents and equipment, making it slow and expensive6,7,8,9. Biopsy provides a wealth of information, but obviously, this method is only suitable for rough estimations10,11. Medical imaging technologies, including magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), and X-ray, are also widely used in glomerular detection12,13,14,15, but such technologies require bulky instruments. New methods, such as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometer16 or the thick and thin section method17, have also been used in glomerular detection, though they remain tedious and laborious.
With the help of transparency technologies, it is possible to observe deeper depths and obtain richer and more complete information from thick tissues or even whole organs18,19,20,21,22,23. Therefore, transparency technologies have been widely used in kidney research24. The observation and detection of glomeruli in the cleared kidneys are also involved. However, these published articles either only briefly referred to glomerular detection25 or used difficult-to-achieve labeling methods such as transgenic animals26, self-produced dyes13, or high-concentration antibody incubation27 to label the glomeruli. In addition, although studies had analyzed glomeruli in cleared kidneys, the analyses were always limited13 or relied on analysis algorithms established by the authors themselves26.
We have previously demonstrated a more convenient way to label the glomeruli in mice kidneys28. By using Imaris, we found that glomeruli count, frequency, and volume could be quickly obtained. Thus, here we present a more accessible, comprehensive, and simplified set of methods to label and analyze the glomeruli of mice kidneys.

تسليط الضوء على المؤلف: مساعدة البحث في بيولوجيا الكلى عن طريق وضع علامات على الكبيبات في الأنسجة التي تم تطهيرها 

طريقة فعالة وسريعة لوضع العلامات وتحليل كبيبات الماوس

Labeling and counting glomeruli using conventional methods can be complicated, tedious, time consuming, and bulky instrument are required. Our method offers an instant and intuitively accurate labeling method for analysis of the glomeruli within the entire kidney. Our technique is a quick, easy, accurate, and cheap method to analyze glomeruli in the entire kidney.It does not require any special equipment, so it can be carried out in any laboratory. This is a groundbreaking, rapid, and simple method to label glomeruli, allowing for an intuitive observation of all the glomeruli within the entire kidney. It holds great potential to assist researchers to make significant breakthroughs in the study of the kidney by providing information such as glomeruli quantity, volume, distribution, and more.On one hand, we're exploring the application of this glomeruli labeling method in clinical kidney disease research. On the other hand, we'll keep working on enhancing methods to label biotargets like blood vessels or specific proteins in transparent tissues, adjusting them to meet our research needs.

توفر هذه الدراسة طريقة بسيطة وفعالة لوضع العلامات وتحليل الكبيبات في كلى الفئران.
يمكن تمييز الكبيبات (الأوعية الدموية) بشكل جيد عن طريق حقن FITC-Dextran داخل الأوعية الدموية. بعد عملية المقاصة ، أصبحت الكلية شفافة (الشكل 1 أ) ، ويمكن ملاحظة الكبيبات بوضوح باستخدا?...

Watch this Scientific Journal Video about Aiding Research in Kidney Biology by Labeling Glomeruli in Cleared Tissues at JoVE.com

تقدم هذه الدراسة مجموعة سهلة الاستخدام وكاملة وبسيطة من الطرق لتسمية وتحليل الكبيبات من كليتي الفئران التي تم تطهيرها من CUBIC. يمكن الحصول على بيانات مثل رقم الكبيبة وحجمها بسهولة وموثوقية باستخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) -Dextran ، أو الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) ، أو الفحص المجهري البؤري المشترك والبرامج مثل Imaris.

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...

يمكن أن يكون وضع العلامات على الكبيبات وعدها باستخدام الطرق التقليدية معقدا ومملا ويستغرق وقتا طويلا ويلزم وجود أداة ضخمة. تقدم طريقتنا طريقة وضع العلامات الفورية والدقيقة بشكل حدسي لتحليل الكبيبات داخل الكلية بأكملها. تقنيتنا هي طريقة سريعة وسهلة ودقيقة ورخيصة لتحليل الكبيبات في الكلى بأكملها.لا يتطلب أي معدات خاصة ، لذلك يمكن تنفيذه في أي مختبر. هذه طريقة رائدة وسريعة وبسيطة لتسمية الكبيبات ، مما يسمح بمراقبة بديهية لجميع الكبيبات داخل الكلية بأكملها. إنه يحمل إمكانات كبيرة لمساعدة الباحثين على تحقيق اختراقات كبيرة في دراسة الكلى من خلال توفير معلومات مثل كمية الكبيبات وحجمها وتوزيعها والمزيد.من ناحية ، نحن نستكشف تطبيق طريقة وضع العلامات على الكبيبات في أبحاث أمراض الكلى السريرية. من ناحية أخرى ، سنواصل العمل على تحسين طرق تسمية الأهداف الحيوية مثل الأوعية الدموية أو بروتينات معينة في الأنسجة الشفافة ، وتعديلها لتلبية احتياجاتنا البحثية.

an-efficient-fast-method-for-labeling-analyzing-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

729 Views.  Sichuan University. يمكن أن يكون وضع العلامات على الكبيبات وعدها باستخدام الطرق التقليدية معقدا ومملا ويستغرق وقتا طويلا ويلزم وجود أداة ضخمة. تقدم طريقتنا طريقة وضع العلامات الفورية والدقيقة بشكل حدسي لتحليل الكبيبات داخل الكلية بأكملها. تقنيتنا هي طريقة سريعة وسهلة ودقيقة ورخيصة لتحليل ا?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: مساعدة البحث في بيولوجيا الكلى عن طريق وضع علامات على الكبيبات في الأنسجة التي تم تطهيرها 

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.