Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82204951) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2020JDRC0102) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Bu çalışmada yetişkin C57BL/6 fareler (6 haftalık, 25-30 g) kullanıldı. Tüm prosedürler, hayvan refahı ve deneysel etiğin yerel düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma, Sichuan Üniversitesi Biyomedikal Araştırma Etik Kurulu Batı Çin Hastanesi tarafından onaylandı.
1. Glomerül etiketleme ve doku hazırlama
<ol><li>Glomerül etiketleme<ol><li>Çalışma probu çözeltisini hazırlamak için FITC-dekstran'ı (10 mg) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1: 1 (1 mg: 1 mL) oranında çözün. NOT: Çalışma solüsyonu 4 °C'de 1 ay saklanabilir.</li>
		<li>C57 fareyi bir fare kuyruğu damar sabitleyicisine yerleştirin. Gazlı bezi sıcak suyla ıslatın, gazlı bezi fare kuyruğunun orta kısmına sarın ve kuyruğu 1 dakika ısıtın.</li>
		<li>Sol ve sağ kuyruk damarları görünene kadar fare kuyruğunu %75 etanol ile silin.</li>
		<li>1 mL'lik bir insülin şırıngası ile 100 μL çalışma probu çözeltisi çekin ve çözeltiyi yavaşça fare kuyruğu damarına enjekte edin.</li>
		<li>Enjeksiyondan sonra, prob çözeltisinin 30 dakika boyunca dolaşmasına izin verin. Farelerin kafeslerinde serbestçe hareket etmelerine izin verin.</li>
		<li>Yeterli dolaşım sağlandıktan sonra, fareleri intraperitoneal sodyum pentobarbital (% 1, 60-80 μg / kg) enjeksiyonu ile derinlemesine uyuşturun.</li>
	</ol></li>
	<li>Böbrek örneklemesi ve fiksasyonu<ol><li>Anestezi uygulanmış fareleri sırtüstü pozisyonda anatomik plakaya sabitleyin. Pençelerini tıbbi bantla sabitleyin.</li>
		<li>Cilt hazırlığından sonra, fareleri öldürücü dozda sodyum pentobarbital (% 1, 10 mg / kg) ile ötenazi yapın.</li>
		<li>Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için orta hat karın kesisi yapın.</li>
		<li>Böbrekleri ortaya çıkarın ve çeker ocakta bir neşter ve makasla çıkarın. Böbrek zarfını nazikçe çıkarın.</li>
		<li>Böbrekleri toplayın ve gece boyunca 4 °C'de% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin.</li>
		<li>Numuneleri PBS ile her biri 1 saat oda sıcaklığında (RT) çalkalanarak üç kez yıkayın.</li>
		<li>Böbreği mikroskopi için hazırlayın.<ol><li>Konfokal mikroskopi için böbreği dilimleyin: Dilim kalınlığını standartlaştırmak için beyin matrisini (1 mm çelik, 40-75 g) kullanarak böbreği 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesin. Dilimleri %4 PFA'ya aktarın ve sabitlemeye gece boyunca 4 °C'de devam edin.</li>
			<li>Işık tabakası mikroskobu için tüm böbrek: Böbrekleri 48 saat boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da sabitleyin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Takas
<ol><li>Reaktif hazırlama<ol><li>%10 (ağırlıkça/ağırlıkça) N-butildietanolamin, %10 (ağırlıkça/ağırlıkça) Triton X-100 ve %80ddH2O'yukarıştırarak CUBIC-L reaktifi hazırlayın.</li>
		<li>%45 (ağırlıkça/ağırlıkça) antipirin, %30 (ağırlıkça/ağırlıkça) nikotinamid, %0.5 (hacim/hacim) N-butildietanolamin ve %24.5 ddH2O'yu karıştırarak CUBIC-R reaktifihazırlayın. Çözeltinin pH'ının 9.6-9.8 ve kırılma indisinin (RI) 1.522 olduğundan emin olun. NOT: CUBIC-L, delipidasyon için kullanılır ve CUBIC-R, kırılma indisi eşleştirmesi için kullanılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Takas prosedürü<ol><li>Böbrek örneklerini 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve ardından 37 ° C'de 60 rpm'de çalkalayarak CUBIC-L'de temizleyin. Tatmin edici optik şeffaflık elde edene kadar CUBIC-L'yi her 4 saatte bir (böbrek dilimleri için) veya her 24 saatte bir (tüm böbrek için) değiştirin. NOT: Bu işlem böbrek dilimleri için 1 gün, bütün bir böbrek için 5 gün sürer.</li>
		<li>Numuneleri PBS'de her biri 1 saat boyunca RT'de hafifçe çalkalayarak üç kez yıkayın.</li>
		<li>CUBIC-R'yi numunelere uygulayın, numuneleri 37 °C'de, 60 rpm'de 6 saat çalkalayın.</li>
		<li>Temizlenmiş numuneleri doğrudan gözlemleyin veya 1 hafta boyunca RT'de CUBIC-R ile doldurulmuş siyah tüplerde saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Görüntü edinme
<ol><li>Konfokal görüntüleme NOT: Dilimlenmiş böbrek örneklerini konfokal mikroskopi ile görüntüleyin (Lensler: A Plan Apo λ 4×/0.2 N1 objektif veya Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 objektif). Z-stacks ile büyük görüntüler (örneğin, böbrek dilimi için 6052 μm x 6052 μm) yakalayın.<ol><li>Konfokal mikroskobu aşağıdaki sırayla açın: lazer gücü, konfokal kontrol anahtarı, bilgisayar, mikroskop ve konfokal donanım. Kendi kendine testi çalıştırdıktan sonra, konfokal yazılımı açın.</li>
		<li>Uygun lensi seçin. Numuneyi CUBIC-R reaktifinden çıkarın, konfokal kaba yerleştirin ve CUBIC-R reaktifinin kurumasını önlemek için üzerini kapatın.</li>
		<li>Örneği görüş alanının ortasına taşıyın ve odak düzlemini odakta olana kadar ayarlayın.</li>
		<li>3B rekonstrüksiyon (adım 3.1.4.1) ve büyük görüntü rekonstrüksiyonu (adım 3.1.4.2-3.1.4.3) uygulayın.<ol><li>3D rekonstrüksiyon (konfokal): Floresan görünmeyene kadar yakınlaştırma düzlemini bir yönde değiştirin; Bu konum üst olarak tanımlanır. Ardından, hiçbir floresan görünmeyene kadar yakınlaştırma düzlemini ters yönde değiştirin; Bu pozisyon dip olarak tanımlanır. Taramayı başlatmak için iletişim kutusunun sağ alt köşesindeki Çalıştır düğmesini tıklatın.</li>
			<li>Büyük görüntü yeniden yapılandırması (konfokal): Görüş alanını örneğin ortasına taşıyın ve geçerli konumu merkez olarak ayarlayın. 2 x 2 görüş alanı seçin.</li>
			<li>ND çok işlevli arabirimde, büyük görüntüleri yeniden oluşturmak ve panelde farklı seçenekler ayarlamak için Z yığınını seçin. Ardından taramayı başlatmak için Butto n çalıştır düğmesine basın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) görüntüleme NOT: Tüm böbrekleri bir ışık tabakası floresan mikroskobu ile görüntüleyin (Lens: EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Orta n = 1.529) objektif).<ol><li>Numune ekleme (LSFM):<ol><li>Şeffaf böbreği numune sabitleme adaptörüne yapıştırın ve böbrek sıkıca takılana kadar bekleyin.</li>
			<li>Böbreği numune kutusuna batırın ve numune kutusunu mikroskop sistemine itin. Kapağı kapatın.</li>
		</ol></li>
		<li>Gözlemle ve tarayın (LSFM):<ol><li>Locate arayüzünde, örneği uygun bir gözlem konumuna taşıyın. Toplama arayüzüne geçin, optik yolu ayarlayın, 488 nm lazer, LBF 405/488/561/640, optik bölme filtre bloğu SBS LP 490'ı seçin, Kamera 2'yi seçin ve sözde rengi yeşil olarak değiştirin.</li>
			<li>Kanal alt menüsünde daha önce kaydedilen Sol/Sağ Z Ofset değerini girin. En küçük yakınlaştırmayı (0,36) seçin ve maksimum netlik için ince ayar yapın.</li>
		</ol></li>
		<li>Tüm organın X\Y sınırını ve Z aralığını bulun. Lazer yoğunluğunu ve pozlama süresini ayarlayın (tercihen 10 ms'den az) ve başlamak için Çalıştır'a tıklayın.</li>
		<li>Doku çok büyükse, iki veya daha fazla görüntüyü görüntü dikişi ile birleştirin. Yakalanan dosyayı mikroskopi yazılımını kullanarak açın (burada, ZEISS ZEN 3.7). Görüntü birleştirmeyi tamamlamak için Stitching > Yöntem Parametresi İşleme > Yöntemi > Yöntemi > Uygula'yı seçin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri işleme ve nicelleştirme
NOT: Glomerülleri etiketlemek ve analiz gerçekleştirmek için Yüzey işlevini kullanarak görüntü yığınlarını Imaris (görüntü analizi) yazılımıyla işleyin.
<ol><li>Glomerül sayısı<ol><li>Büyük görüntüleri (konfokal mikroskopi) veya dikişli görüntüleri (ışık tabakası mikroskobu) görüntü analiz yazılımına aktarın.</li>
		<li>Dosyaları görüntü analizi yazılımında açın. Yeni bir Yüzey oluşturmak için Yüzey düğmesine tıklayın. Ekranın sol alt kısmındaki kılavuzu izleyin.<ol><li>Hiçbir şeyi işaretlemeden İleri düğmesine (sağ ok düğmesi) tıklayın.</li>
			<li>Pürüzsüz seçeneğinin önündeki kutuyu işaretleyin ve Yüzeyin ayrıntısını kontrol etmek için uygun bir sayı (örneğin, 14.5) girin. Thresholding'de Arka Plan Çıkarma'yı seçin ve kutuyu glomerüllerin yaklaşık ortalama çapıyla doldurun. İleri düğmesine tıklayın.</li>
			<li>Gerekirse ayarlayın ve İleri düğmesine tıklayın. Uygun aralığı seçin ve Sonraki Bir Yüzey oluşturmak için düğmesine basın.</li>
		</ol></li>
		<li>Tıkla filtre ve ardından Ekle Küresel olmayan nesneleri filtrelemek için Küresellik eklemek için düğmesine basın. Bu yeni yüzeyi kopyalamak için Çoğalt düğmesine tıklayın.</li>
		<li>İstatistikler düğmesini ve ardından Genel düğmesini tıklayın; yazılım, glomerül sayısını Toplam Yüzey Sayısı olarak sunacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Glomerül hacmi<ol><li>Yukarıdaki gibi glomerüllerin bir yüzeyini oluşturun.</li>
		<li>Yüzey tamamlandığında, hedef nesneleri seçmek ve her nesnenin hacmini sunmak için Seçim düğmesine tıklayın. Kaydet düğmesini tıklayın ve daha fazla analiz için istatistikleri bir e-tabloya aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dilimin veya tüm böbreğin hacmi<ol><li>Büyük görüntüleri (konfokal mikroskopi) veya dikişli görüntüleri (ışık tabakası mikroskobu) görüntü analiz yazılımına aktarın.</li>
		<li>Dosyaları görüntü analizi yazılımında açın. Yeni bir Yüzey oluşturmak için Yüzey düğmesine tıklayın. Ekranın sol alt kısmındaki kılavuzu izleyin.<ol><li>Tıklamadan İleri düğmesine (sağ ok düğmesi) tıklayın.</li>
			<li>Pürüzsüz seçeneğinin önündeki kutuyu işaretleyin ve Yüzeyin ayrıntısını kontrol etmek için uygun bir sayı (örneğin 50) girin. Thresholding'de Absolute Intensity (Mutlak Yoğunluk) seçeneğini belirleyin. İleri düğmesine tıklayın.</li>
			<li>Yüzeyi tüm dokuyu kaplayana kadar ayarlayın ve Sonraki düğmesine basın. Yüzeyi oluşturmak için İleri düğmesine tıklayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Tıkla Seçim Tüm dokunun Yüzeyini seçmek ve dokunun hacmini sunmak için düğmesine basın. İstatistikleri bir e-tabloya aktarmak için Kaydet düğmesini tıklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Mikroskopi için Temizlenmiş Fare Böbreklerinde Glomerüllerin Floresan Etiketlenmesi

<ol>
	<li>Hoy, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+number,+glomerular+volume,+renal+disease+and+hypertension.">Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).</li><li>Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nephron+number:+implications+for+health+and+disease.">Human nephron number: implications for health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).</li><li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age,+kidney+weight,+and+body+surface+in+normal+man.">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).</li><li>Rasch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+diabetic+glomerulopathy+in+streptozotocin+diabetic+rats+by+insulin+treatment.+Kidney+size+and+glomerular+volume.">Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume.</a> Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+number+and+size+variability+and+risk+for+kidney+disease.">Glomerular number and size variability and risk for kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).</li><li>Bertram, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+and+how+we+determine+nephron+number.">Why and how we determine nephron number.</a> Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).</li><li>Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+numbers+of+glomeruli+and+individual+glomerular+cell+types+in+the+normal+rat+kidney.">Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+renal+glomeruli+with+the+new+stereology.">Analyzing renal glomeruli with the new stereology.</a> International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).</li><li>L&#248;drup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+biopsies+can+be+used+for+estimations+of+glomerular+number+and+volume:+a+pig+study.">Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study.</a> Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).</li><li>Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+glomerular+volume:+a+comparison+of+four+methods.">Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods.</a> Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).</li><li>Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurements+of+kidney+glomerular+number+and+size+in+healthy+and+Os(/+)+mice+using+MRI.">In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cationic+near+infrared+fluorescent+agent+and+ethyl-cinnamate+tissue+clearing+protocol+for+vascular+staining+and+imaging.">A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).</li><li>Beeman, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+glomerular+number+and+size+in+perfused+kidneys+using+MRI.">Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).</li><li>Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+glomerular+number+in+situ+using+magnetic+resonance+imaging+and+biopsy.">Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy.</a> Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).</li><li>Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+molecular+imaging+of+the+kidney.">Label-free molecular imaging of the kidney.</a> Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).</li><li>Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+thick+and+thin+section+method+for+estimation+of+podocyte+number,+glomerular+volume,+and+glomerular+volume+per+podocyte+in+rat+kidney+with+Wilms'+tumor-1+protein+used+as+a+podocyte+nuclear+marker.">Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Lloyd-Lewis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mammary+gland+and+mammary+tumours+in+3D:+optical+tissue+clearing+and+immunofluorescence+methods.">Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC-plus:+An+optimized+method+for+rapid+tissue+clearing+and+decolorization.">CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+combinations+of+fluorescent+vessel+labeling+and+tissue+clearing+methods+for+three-dimensional+visualization+of+vasculature.">Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature.</a> Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Bai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+vascular+network+labeling+method+for+transparent+tissues+of+mice.">A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice.</a> Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kolesov&#225;, H., Olejn&#237;&#269;kov&#225;, V., Kvasilov&#225;, A., Gregorovi&#269;ov&#225;, M., Sedmera, D. J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+imaging+methods+for+cardiovascular+development.">Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development.</a> Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLARITY-based+tissue+clearing+and+imaging.">Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging.</a> Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).</li><li>Ert&#252;rk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).</li></ol>

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Doku temizleme teknolojileri 3 veya 4 grupta sınıflandırılabilir 29,30,31. Organik çözücü bazlı doku temizleme (örneğin, DISCO ve PEGASOS), su bazlı doku temizleme (örneğin, CUBIC) ve hidrojel gömme doku temizleme (örneğin, CLARITY) böbrek temizlemede uygulanmıştır 25,26,28,32. CUB...

Glomerüllerin sayısı ve hacmi çeşitli böbrek hastalıklarının tanı ve tedavisi için çok önemlidir 1,2,3,4,5. Glomerül sayısı tahmininin altın standardı, fiziksel disektör/fraksiyonatör kombinasyonudur. Bununla birlikte, bu yöntem özel reaktifler ve ekipman gerektirir, bu da onu yavaş ve pahalı hale getirir 6,7,8,9. Biyopsi zengin bir bilgi sağlar, ancak açıkçası, bu yöntem yalnızca kaba tahminler için uygundur10,11. Manyetik rezonans görüntüleme (MRI), bilgisayarlı tomografi (BT) ve X-ışını dahil olmak üzere tıbbi görüntüleme teknolojileri de glomerüler algılamada yaygın olarak kullanılmaktadır 12,13,14,15, ancak bu tür teknolojiler hantal aletler gerektirir. Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) görüntüleme kütle spektrometresi16 veya kalın ve ince kesit yöntemi17 gibi yeni yöntemler de glomerüler tespitte kullanılmıştır, ancak bunlar sıkıcı ve zahmetli olmaya devam etmektedir.
Şeffaflık teknolojilerinin yardımıyla, daha derin derinlikleri gözlemlemek ve kalın dokulardan ve hatta tüm organlardan daha zengin ve daha eksiksiz bilgi elde etmek mümkündür 18,19,20,21,22,23. Bu nedenle, şeffaflık teknolojileri böbrek araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır24. Temizlenen böbreklerde glomerüllerin gözlemlenmesi ve tespiti de söz konusudur. Bununla birlikte, yayınlanan bu makaleler ya sadece kısaca glomerüler tespit25'e atıfta bulundu ya da glomerülleri etiketlemek için transgenik hayvanlar26, kendi kendine üretilen boyalar13 veya yüksek konsantrasyonlu antikor inkübasyonu27 gibi elde edilmesi zor etiketleme yöntemlerini kullandı. Ek olarak, çalışmalar temizlenmiş böbreklerdeki glomerülleri analiz etmiş olsa da, analizler her zaman sınırlıydı13 veya yazarların kendileri tarafından oluşturulan analiz algoritmalarınadayanıyordu 26.
Daha önce farelerin böbreklerinde glomerülleri etiketlemenin daha uygun bir yolunu göstermiştik28. Imaris'i kullanarak, glomerül sayısının, frekansının ve hacminin hızlı bir şekilde elde edilebileceğini bulduk. Bu nedenle, burada fare böbreklerinin glomerüllerini etiketlemek ve analiz etmek için daha erişilebilir, kapsamlı ve basitleştirilmiş bir dizi yöntem sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>7007171800</td>
			<td>Fixation reaagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>502 Glue&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>7146</td>
			<td>For fixing the kidney to the sample fixing adapter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipyrine</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A110660</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Matrix</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>1mm 40-75</td>
			<td>Tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1plus</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD150S</td>
			<td>Labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet fluorescence microscopy&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Light sheet 7&#160;</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Ensiweier</td>
			<td></td>
			<td>Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25&#8211;30 g)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Butyldiethanolamine</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>B299095</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>N105042</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Natriumsalz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail vein fixator</td>
			<td>JINUOTAI</td>
			<td>JNT-FS35</td>
			<td>Fix the mouse for vail injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and fast method for labeling and analyzing mouse glomeruli

Glomerüller böbrekteki temel birimlerdir; Bu nedenle, glomerülleri incelemek, böbrek fonksiyonunu ve patolojisini anlamak için çok önemlidir. Biyolojik görüntüleme sezgisel bilgi sağlar; Bu nedenle, glomerülleri etiketlemek ve gözlemlemek büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şu anda kullanılmakta olan glomerül gözlem yöntemleri karmaşık işlemler gerektirir ve sonuçlar etiket ayrıntılarını veya üç boyutlu (3D) bilgileri kaybedebilir. Net, engelsiz beyin görüntüleme kokteylleri ve hesaplamalı analiz (CUBIC) doku temizleme teknolojisi, böbrek araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve daha doğru tespit ve daha derin tespit derinliği sağlar. Fare glomerüllerinin, orta moleküler ağırlıklı FITC-Dekstran'ın kuyruk damarı enjeksiyonu ve ardından CUBIC temizleme yöntemi ile hızlı ve etkili bir şekilde etiketlenebileceğini bulduk. Temizlenen fare böbreği, tüm böbrekteki tüm glomerüllerin üç boyutlu görüntü yığınlarını elde etmek için bir ışık tabakası mikroskobu (veya dilimlendiğinde konfokal bir mikroskop) ile taranabilir. Uygun yazılımla işlenen glomerül sinyalleri, glomerüllerin sayısını, hacmini ve frekansını ölçmek için kolayca sayısallaştırılabilir ve daha fazla analiz edilebilir.

The number and volume of glomeruli are very important for the diagnosis and treatment of various kidney diseases1,2,3,4,5. The golden standard of glomeruli number estimation is the physical dissector/fractionator combination. However, this method requires special reagents and equipment, making it slow and expensive6,7,8,9. Biopsy provides a wealth of information, but obviously, this method is only suitable for rough estimations10,11. Medical imaging technologies, including magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), and X-ray, are also widely used in glomerular detection12,13,14,15, but such technologies require bulky instruments. New methods, such as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometer16 or the thick and thin section method17, have also been used in glomerular detection, though they remain tedious and laborious.
With the help of transparency technologies, it is possible to observe deeper depths and obtain richer and more complete information from thick tissues or even whole organs18,19,20,21,22,23. Therefore, transparency technologies have been widely used in kidney research24. The observation and detection of glomeruli in the cleared kidneys are also involved. However, these published articles either only briefly referred to glomerular detection25 or used difficult-to-achieve labeling methods such as transgenic animals26, self-produced dyes13, or high-concentration antibody incubation27 to label the glomeruli. In addition, although studies had analyzed glomeruli in cleared kidneys, the analyses were always limited13 or relied on analysis algorithms established by the authors themselves26.
We have previously demonstrated a more convenient way to label the glomeruli in mice kidneys28. By using Imaris, we found that glomeruli count, frequency, and volume could be quickly obtained. Thus, here we present a more accessible, comprehensive, and simplified set of methods to label and analyze the glomeruli of mice kidneys.

Yazar Spotlight: Temizlenmiş Dokularda Glomerülleri Etiketleyerek Böbrek Biyolojisi Araştırmalarına Yardımcı Olmak 

Fare Glomerüllerini Etiketlemek ve Analiz Etmek için Etkili ve Hızlı Bir Yöntem

Bu çalışma, fare böbreklerindeki glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için basit ve etkili bir yöntem sunmaktadır.
Glomerüller (kan damarları) intravasküler olarak enjekte edilen FITC-Dekstran ile iyi bir şekilde etiketlenebilir. Temizleme işleminden sonra böbrek saydam hale geldi (Şekil 1A) ve glomerüller ışık tabakası mikroskobu (Şekil 1B) veya konfokal mikroskopi (Şekil 1C) ku...

Watch this Scientific Journal Video about Aiding Research in Kidney Biology by Labeling Glomeruli in Cleared Tissues at JoVE.com

Bu çalışma, CUBIC temizlenmiş fare böbreklerinden glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için kullanımı kolay, eksiksiz ve basit bir dizi yöntem sunmaktadır. Glomerulus sayısı ve hacmi gibi veriler, floresein izotiyosiyanat (FITC)-Dekstran, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) veya yaygın konfokal mikroskopi ve Imaris gibi yazılımlar kullanılarak kolay ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir.

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...

Glomerüllerin geleneksel yöntemlerle etiketlenmesi ve sayılması karmaşık, sıkıcı, zaman alıcı olabilir ve hantal bir alet gerekebilir. Yöntemimiz, tüm böbrekteki glomerüllerin analizi için anında ve sezgisel olarak doğru bir etiketleme yöntemi sunar. Tekniğimiz, tüm böbrekteki glomerülleri analiz etmek için hızlı, kolay, doğru ve ucuz bir yöntemdir.Herhangi bir özel ekipman gerektirmez, bu nedenle herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu, glomerülleri etiketlemek için çığır açan, hızlı ve basit bir yöntemdir ve tüm böbrekteki tüm glomerüllerin sezgisel bir gözlemine izin verir. Glomerül miktarı, hacmi, dağılımı ve daha fazlası gibi bilgiler sağlayarak araştırmacıların böbrek çalışmasında önemli atılımlar yapmalarına yardımcı olmak için büyük bir potansiyele sahiptir.Bir yandan, bu glomerül etiketleme yönteminin klinik böbrek hastalığı araştırmalarında uygulanmasını araştırıyoruz. Öte yandan, kan damarları veya şeffaf dokulardaki spesifik proteinler gibi biyohedefleri etiketlemek için yöntemler geliştirmeye devam edeceğiz ve bunları araştırma ihtiyaçlarımızı karşılayacak şekilde ayarlayacağız.

an-efficient-fast-method-for-labeling-analyzing-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

743 Görüntüleme.  Sichuan University. Glomerüllerin geleneksel yöntemlerle etiketlenmesi ve sayılması karmaşık, sıkıcı, zaman alıcı olabilir ve hantal bir alet gerekebilir. Yöntemimiz, tüm böbrekteki glomerüllerin analizi için anında ve sezgisel olarak doğru bir etiketleme yöntemi sunar. Tekniğimiz, tüm böbrekteki glomerülleri analiz etmek için hızlı, kolay, doğru ve ucuz bir yöntemdir.Herhangi bir özel ekipman gerektirmez, bu nedenle herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu, glome...

Video: Yazar Spotlight: Temizlenmiş Dokularda Glomerülleri Etiketleyerek Böbrek Biyolojisi Araştırmalarına Yardımcı Olmak 

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.