Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82204951) und des Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102) unterstützt.

In dieser Studie wurden adulte C57BL/6-Mäuse (6 Wochen alt, 25-30 g) verwendet. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den lokalen Vorschriften des Tierschutzes und der experimentellen Ethik durchgeführt. Die Studie wurde von der Ethikkommission für biomedizinische Forschung des Westchinesischen Krankenhauses der Universität Sichuan genehmigt.
1. Glomeruli-Markierung und Gewebevorbereitung
<ol><li>Glomeruli-Etikettierung<ol><li>FITC-Dextran (10 mg) wird in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 (1 mg: 1 ml) gelöst, um die Arbeitssondenlösung herzustellen. HINWEIS: Die Arbeitslösung kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.</li>
		<li>Legen Sie die C57-Maus in einen Mausschwanzvenen-Fixateur. Befeuchten Sie die Gaze mit heißem Wasser, wickeln Sie die Gaze um den mittleren Teil des Mäuseschwanzes und erwärmen Sie den Schwanz 1 Minute lang.</li>
		<li>Wischen Sie den Mäuseschwanz mit 75%igem Ethanol ab, bis die linke und rechte Schwanzvene sichtbar sind.</li>
		<li>Ziehen Sie 100 μl der Arbeitssondenlösung mit einer 1-ml-Insulinspritze und injizieren Sie die Lösung langsam in die Schwanzvene der Maus.</li>
		<li>Nach der Injektion die Sondenlösung 30 Minuten lang zirkulieren lassen. Lassen Sie die Mäuse sich in ihren Käfigen frei bewegen.</li>
		<li>Sobald eine ausreichende Durchblutung erreicht ist, werden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (1%, 60-80 μg/kg) tief betäubt.</li>
	</ol></li>
	<li>Nierenentnahme und -fixierung<ol><li>Befestigen Sie die anästhesierten Mäuse in Rückenlage an der anatomischen Platte. Befestigen Sie ihre Pfoten mit medizinischem Klebeband.</li>
		<li>Nach der Hautvorbereitung werden die Mäuse mit einer tödlichen Dosis Natrium-Pentobarbital (1%, 10 mg/kg) eingeschläfert.</li>
		<li>Machen Sie einen Bauchschnitt in der Mittellinie, um die Bauchhöhle freizulegen.</li>
		<li>Legen Sie die Nieren frei und entfernen Sie sie mit einem Skalpell und einer Schere aus dem Abzug. Entfernen Sie die Nierenhülle vorsichtig.</li>
		<li>Sammeln Sie die Nieren und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C über Nacht.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben mit PBS dreimal jeweils 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur (RT).</li>
		<li>Bereiten Sie die Niere für die Mikroskopie vor.<ol><li>Schneiden Sie die Niere für die konfokale Mikroskopie: Schneiden Sie die Niere mit Hilfe der Gehirnmatrix (1 mm Stahl, 40-75 g) in 1 mm dicke Scheiben, um die Schichtdicke zu standardisieren. Die Scheiben in 4% PFA überführen und die Fixierung bei 4 °C über Nacht fortsetzen.</li>
			<li>Ganze Niere für die Lichtblattmikroskopie: Fixieren Sie die Nieren in 4% PFA bei 4 °C für 48 Stunden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Verrechnung
<ol><li>Vorbereitung der Reagenzien<ol><li>Bereiten Sie das CUBIC-L-Reagenz vor, indem Sie 10 % (Gew./Gew.) N-Butyldiethanolamin, 10 Gew.-% (Gew./Gew.) Triton X-100 und 80 %ddH2O mischen.</li>
		<li>Bereiten Sie das CUBIC-R-Reagenz vor, indem Sie 45 % (wt/wt) Antipyrin, 30 % (wt/wt) Nicotinamid, 0,5 % (vol/vol) N-Butyldiethanolamin und 24,5 %ddH2Omischen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung einen pH-Wert von 9,6-9,8 und einen Brechungsindex (RI) von 1,522 hat. HINWEIS: CUBIC-L wird für die Delipidierung und CUBIC-R für die Anpassung des Brechungsindex verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Clearing-Verfahren<ol><li>Die Nierenproben werden in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und dann in CUBIC-L unter Schütteln bei 60 U/min bei 37 °C gereinigt. Tauschen Sie CUBIC-L alle 4 Stunden (für Nierenscheiben) oder alle 24 Stunden (für eine ganze Niere) aus, bis eine zufriedenstellende optische Transparenz erreicht ist. HINWEIS: Dieser Vorgang dauert 1 Tag für Nierenscheiben und 5 Tage für eine ganze Niere.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben dreimal in PBS mit leichtem Schütteln bei RT für jeweils 1 Stunde.</li>
		<li>CUBIC-R auf die Proben auftragen und die Proben 6 h lang bei 37 °C und 60 U/min schütteln.</li>
		<li>Beobachten Sie die geklärten Proben direkt oder lagern Sie sie 1 Woche lang in schwarzen Röhrchen, die mit CUBIC-R bei RT gefüllt sind.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bildaufnahme
<ol><li>Konfokale Bildgebung HINWEIS: Fotografieren Sie die geschnittenen Nierenproben mit konfokaler Mikroskopie (Objektive: Ein Plan Apo λ 4×/0.2 N1 Objektiv oder ein Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 Objektiv). Erfassen Sie große Bilder (z. B. 6052 μm x 6052 μm für die Nierenschicht) mit Z-Stapeln.<ol><li>Schalten Sie das konfokale Mikroskop in der folgenden Reihenfolge ein: Laserleistung, konfokaler Steuerschalter, Computer, Mikroskop und konfokale Hardware. Schalten Sie nach dem Ausführen des Selbsttests die konfokale Software ein.</li>
		<li>Wählen Sie das entsprechende Objektiv aus. Nehmen Sie die Probe aus dem CUBIC-R-Reagenz, legen Sie sie in die konfokale Schale und decken Sie sie ab, um ein Austrocknen des CUBIC-R-Reagenzes zu verhindern.</li>
		<li>Verschieben Sie die Probe in die Mitte des Sichtfelds und passen Sie die Fokusebene an, bis sie scharf ist.</li>
		<li>Wenden Sie die 3D-Rekonstruktion (Schritt 3.1.4.1) und die Rekonstruktion großer Bilder (Schritte 3.1.4.2-3.1.4.3) an.<ol><li>3D-Rekonstruktion (konfokal): Schalten Sie die Zoomebene in eine Richtung, bis keine Fluoreszenz mehr sichtbar ist; Diese Position wird als Spitze definiert. Schalten Sie dann die Zoomebene in die entgegengesetzte Richtung, bis keine Fluoreszenz mehr sichtbar ist. Diese Position wird als Boden definiert. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen in der unteren rechten Ecke des Dialogfelds, um den Scanvorgang zu starten.</li>
			<li>Große Bildrekonstruktion (konfokal): Verschieben Sie das Sichtfeld in die Mitte der Probe und legen Sie die aktuelle Position als Mittelpunkt fest. Wählen Sie ein 2 x 2-Sichtfeld aus.</li>
			<li>Wählen Sie in der ND-Multifunktionsschnittstelle den Z-Stapel aus, um große Bilder zu rekonstruieren, und legen Sie verschiedene Optionen im Bedienfeld fest. Drücken Sie dann die Taste Ausführen , aber, um den Scanvorgang zu starten.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Bildgebung der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) HINWEIS: Fotografieren Sie die gesamten Nieren mit einem Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (Objektiv: EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (Medium n = 1,529) Objektiv).<ol><li>Probenanbringung (LSFM):<ol><li>Kleben Sie die durchsichtige Niere auf den Adapter zur Probenfixierung und warten Sie, bis die Niere fest befestigt ist.</li>
			<li>Weichen Sie die Niere in den Probenbehälter ein und schieben Sie den Probenbehälter in das Mikroskopsystem. Schließen Sie die Luke.</li>
		</ol></li>
		<li>Beobachten und scannen (LSFM):<ol><li>Verschieben Sie die Probe in der Lokalisierungsschnittstelle an eine geeignete Beobachtungsposition. Wechseln Sie zur Erfassungsschnittstelle , stellen Sie den optischen Pfad ein, wählen Sie 488-nm-Laser, LBF 405/488/561/640, optischen Splitting-Filterblock SBS LP 490, wählen Sie Kamera 2 und ändern Sie die Pseudofarbe in Grün.</li>
			<li>Geben Sie den Wert für den Z-Versatz links/rechts ein, der zuvor im Untermenü Kanal aufgezeichnet wurde. Wählen Sie den kleinsten Zoom (0,36) und passen Sie ihn für maximale Klarheit an.</li>
		</ol></li>
		<li>Finde die X\Y-Grenze und den Z-Bereich des gesamten Organs. Stellen Sie die Laserintensität und die Belichtungszeit ein (vorzugsweise weniger als 10 ms) und klicken Sie auf Ausführen , um zu starten.</li>
		<li>Wenn das Gewebe zu groß ist, fügen Sie zwei oder mehr Bilder mit Bildzusammenfügen zusammen. Öffnen Sie die aufgenommene Datei mit der Mikroskopie-Software (hier ZEISS ZEN 3.7). Wählen Sie Verarbeitung > Methode > Stitching > Methodenparameter > Auf vollständiges Bild-Stitching anwenden.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenverarbeitung und Quantifizierung
HINWEIS: Verarbeiten Sie die Bildstapel mit der Software Imaris (Bildanalyse), indem Sie die Funktion Oberfläche verwenden, um die Glomeruli zu beschriften und eine Analyse durchzuführen.
<ol><li>Graf der Glomeruli<ol><li>Importieren Sie große Bilder (konfokale Mikroskopie) oder zusammengefügte Bilder (Lichtblattmikroskopie) in die Bildanalysesoftware.</li>
		<li>Öffnen Sie die Dateien in der Bildanalysesoftware. Klicken Sie auf die Schaltfläche Oberfläche , um eine neue Oberfläche zu erstellen. Folgen Sie der Anleitung unten links auf dem Bildschirm.<ol><li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter (Pfeil nach rechts), ohne etwas anzukreuzen.</li>
			<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen vor der Option Glätten und geben Sie eine geeignete Zahl ein (z. B. 14,5), um die Details der Oberfläche zu steuern. Wählen Sie Hintergrundsubtraktion in Schwellenwert und füllen Sie das Feld mit dem ungefähren durchschnittlichen Durchmesser der Glomeruli. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter .</li>
			<li>Passen Sie die Einstellungen bei Bedarf an und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter . Wählen Sie den richtigen Bereich aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um eine Oberfläche zu erstellen.</li>
		</ol></li>
		<li>Klicken Sie auf "Filter" und dann auf die Schaltfläche "Hinzufügen ", um "Sphärizität " hinzuzufügen und nicht-sphärische Objekte herauszufiltern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Duplizieren , um diese neue Oberfläche zu kopieren.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Taste "Statistik" und dann auf die Schaltfläche "Gesamt ". Die Software zeigt die Anzahl der Glomeruli als Gesamtanzahl der Oberfläche an.</li>
	</ol></li>
	<li>Volumen der Glomeruli<ol><li>Erstelle eine Oberfläche der Glomeruli wie oben.</li>
		<li>Wenn die Oberfläche fertig ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl , um die Zielobjekte auszuwählen und das Volumen jedes Objekts darzustellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und exportieren Sie die Statistiken zur weiteren Analyse in eine Tabelle.</li>
	</ol></li>
	<li>Volumen der Scheibe oder der ganzen Niere<ol><li>Importieren Sie große Bilder (konfokale Mikroskopie) oder zusammengefügte Bilder (Lichtblattmikroskopie) in die Bildanalysesoftware.</li>
		<li>Öffnen Sie Dateien in der Bildanalyse-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Oberfläche , um eine neue Oberfläche zu erstellen. Folgen Sie der Anleitung unten links auf dem Bildschirm.<ol><li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter (Schaltfläche mit dem Pfeil nach rechts), ohne ein Häkchen zu setzen.</li>
			<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen vor der Option Glatt und geben Sie eine geeignete Zahl (z. B. 50) ein, um die Details der Oberfläche zu steuern. Wählen Sie Absolute Intensität unter Schwellenwert aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter .</li>
			<li>Passen Sie die Oberfläche an, bis sie das gesamte Gewebe bedeckt, und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter . Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um die Oberfläche zu erstellen.</li>
		</ol></li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl , um die Oberfläche des gesamten Gewebes auszuwählen und das Volumen des Gewebes darzustellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um Statistiken in eine Tabelle zu exportieren.</li>
	</ol></li>
</ol>

Fluoreszenzmarkierung von Glomeruli in geklärten Mausnieren für die Mikroskopie

<ol>
	<li>Hoy, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+number,+glomerular+volume,+renal+disease+and+hypertension.">Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).</li><li>Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nephron+number:+implications+for+health+and+disease.">Human nephron number: implications for health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).</li><li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+imaging+methods+for+cardiovascular+development.">Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development.</a> Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLARITY-based+tissue+clearing+and+imaging.">Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging.</a> Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).</li><li>Ert&#252;rk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).</li></ol>

Alle Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Tissue-Clearing-Technologien können in 3 oder 4 Gruppen eingeteiltwerden 29,30,31. Organisches Gewebe-Clearing auf Lösungsmittelbasis (z. B. DISCO und PEGASOS), Gewebe-Clearing auf wässriger Basis (z. B. CUBIC) und Hydrogel-einbettendes Gewebe-Clearing (z. B. CLARITY) wurden alle bei der Nierenreinigung angewendet 25,26,28,32.</...

Die Anzahl und das Volumen der Glomeruli sind sehr wichtig für die Diagnose und Behandlung verschiedener Nierenerkrankungen 1,2,3,4,5. Der goldene Standard der Glomeruli-Zahlschätzung ist die Kombination aus physikalischem Dissektor und Fraktionierer. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Reagenzien und Geräte, was sie langsam und teuer macht 6,7,8,9. Die Biopsie liefert eine Fülle von Informationen, aber offensichtlich ist diese Methode nur für grobe Schätzungen geeignet10,11. Medizinische Bildgebungstechnologien, einschließlich Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT) und Röntgen, sind ebenfalls bei der glomerulären Detektion weit verbreitet 12,13,14,15, aber solche Technologien erfordern sperrige Instrumente. Neue Methoden, wie z. B. das matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometer16 oder das Dick- und Dünnschliffverfahren17, wurden ebenfalls in der glomerulären Detektion eingesetzt, obwohl sie nach wie vor mühsam und mühsam sind.
Mit Hilfe von Transparenztechnologien ist es möglich, tiefere Tiefen zu beobachten und reichhaltigere und vollständigere Informationen aus dickem Gewebe oder sogar ganzen Organen zu erhalten 18,19,20,21,22,23. Daher sind Transparenztechnologien in der Nierenforschung weit verbreitet24. Auch die Beobachtung und der Nachweis von Glomeruli in den gereinigten Nieren gehören dazu. Diese veröffentlichten Artikel bezogen sich jedoch entweder nur kurz auf den glomerulären Nachweis25 oder verwendeten schwierig zu erreichende Markierungsmethoden wie transgene Tiere26, selbst hergestellte Farbstoffe13 oder hochkonzentrierte Antikörperinkubation27 zur Markierung der Glomeruli. Obwohl Studien Glomeruli in gereinigten Nieren analysiert hatten, waren die Analysen immer begrenzt13 oder stützten sich auf Analysealgorithmen, die von den Autoren selbst entwickelt wurden26.
Wir haben bereits einen bequemeren Weg zur Markierung der Glomeruli in den Nieren von Mäusen gezeigt28. Durch die Verwendung von Imaris stellten wir fest, dass die Anzahl, Häufigkeit und das Volumen der Glomeruli schnell ermittelt werden konnten. Daher stellen wir hier einen zugänglicheren, umfassenderen und vereinfachten Satz von Methoden zur Markierung und Analyse der Glomeruli von Mäusenieren vor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>7007171800</td>
			<td>Fixation reaagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>502 Glue&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>7146</td>
			<td>For fixing the kidney to the sample fixing adapter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipyrine</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A110660</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Matrix</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>1mm 40-75</td>
			<td>Tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1plus</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD150S</td>
			<td>Labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet fluorescence microscopy&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Light sheet 7&#160;</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Ensiweier</td>
			<td></td>
			<td>Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25&#8211;30 g)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Butyldiethanolamine</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>B299095</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>N105042</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Natriumsalz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail vein fixator</td>
			<td>JINUOTAI</td>
			<td>JNT-FS35</td>
			<td>Fix the mouse for vail injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and fast method for labeling and analyzing mouse glomeruli

Die Glomeruli sind grundlegende Einheiten in der Niere; Daher ist die Untersuchung der Glomeruli von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Nierenfunktion und -pathologie. Die biologische Bildgebung liefert intuitive Informationen; Daher ist es von großer Bedeutung, die Glomeruli zu beschriften und zu beobachten. Die derzeit verwendeten Glomeruli-Beobachtungsmethoden erfordern jedoch komplizierte Operationen, und die Ergebnisse können Markierungsdetails oder dreidimensionale (3D) Informationen verlieren. Die klare, ungehinderte Brain-Imaging-Cocktails und die Computational Analysis (CUBIC)-Gewebereinigungstechnologie sind in der Nierenforschung weit verbreitet und ermöglichen eine genauere Detektion und eine tiefere Detektionstiefe. Wir fanden heraus, dass Maus-Glomeruli schnell und effektiv durch Schwanzveneninjektion von mittelmolekularem FITC-Dextran gefolgt von der CUBIC-Clearing-Methode markiert werden können. Die gereinigte Mausniere konnte mit einem Lichtblattmikroskop (oder einem konfokalen Mikroskop, wenn sie geschnitten wurde) gescannt werden, um dreidimensionale Bildstapel aller Glomeruli in der gesamten Niere zu erhalten. Mit entsprechender Software verarbeitet, konnten die Glomeruli-Signale leicht digitalisiert und weiter analysiert werden, um die Anzahl, das Volumen und die Frequenz der Glomeruli zu messen.

The number and volume of glomeruli are very important for the diagnosis and treatment of various kidney diseases1,2,3,4,5. The golden standard of glomeruli number estimation is the physical dissector/fractionator combination. However, this method requires special reagents and equipment, making it slow and expensive6,7,8,9. Biopsy provides a wealth of information, but obviously, this method is only suitable for rough estimations10,11. Medical imaging technologies, including magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), and X-ray, are also widely used in glomerular detection12,13,14,15, but such technologies require bulky instruments. New methods, such as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometer16 or the thick and thin section method17, have also been used in glomerular detection, though they remain tedious and laborious.
With the help of transparency technologies, it is possible to observe deeper depths and obtain richer and more complete information from thick tissues or even whole organs18,19,20,21,22,23. Therefore, transparency technologies have been widely used in kidney research24. The observation and detection of glomeruli in the cleared kidneys are also involved. However, these published articles either only briefly referred to glomerular detection25 or used difficult-to-achieve labeling methods such as transgenic animals26, self-produced dyes13, or high-concentration antibody incubation27 to label the glomeruli. In addition, although studies had analyzed glomeruli in cleared kidneys, the analyses were always limited13 or relied on analysis algorithms established by the authors themselves26.
We have previously demonstrated a more convenient way to label the glomeruli in mice kidneys28. By using Imaris, we found that glomeruli count, frequency, and volume could be quickly obtained. Thus, here we present a more accessible, comprehensive, and simplified set of methods to label and analyze the glomeruli of mice kidneys.

Autor im Rampenlicht: Unterstützung der Forschung in der Nierenbiologie durch Markierung von Glomeruli in geklärten Geweben 

Eine effiziente und schnelle Methode zur Markierung und Analyse von Mausglomeruli

Diese Studie bietet eine einfache und effiziente Methode zur Markierung und Analyse der Glomeruli in Mäusenieren.
Glomeruli (Blutgefäße) können durch intravaskulär injiziertes FITC-Dextran gut markiert werden. Nach dem Reinigungsprozess wurde die Niere durchsichtig (Abbildung 1A), und die Glomeruli konnten mit Hilfe der Lichtblattmikroskopie (Abbildung 1B) oder der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 1C</strong...

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Diese Studie stellt eine einfach anzuwendende, vollständige und einfache Reihe von Methoden zur Markierung und Analyse von Glomeruli aus CUBIC-geräumten Mäusenieren vor. Daten wie Glomeruluszahl und -volumen können einfach und zuverlässig mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran, Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) oder gängiger konfokaler Mikroskopie und Software wie Imaris gewonnen werden.

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...

Das Markieren und Zählen von Glomeruli mit herkömmlichen Methoden kann kompliziert, mühsam und zeitaufwändig sein, und es sind sperrige Geräte erforderlich. Unsere Methode bietet eine sofortige und intuitiv genaue Markierungsmethode für die Analyse der Glomeruli in der gesamten Niere. Unsere Technik ist eine schnelle, einfache, genaue und kostengünstige Methode zur Analyse von Glomeruli in der gesamten Niere.Es erfordert keine spezielle Ausrüstung, so dass es in jedem Labor durchgeführt werden kann. Dies ist eine bahnbrechende, schnelle und einfache Methode zur Markierung von Glomeruli, die eine intuitive Beobachtung aller Glomeruli in der gesamten Niere ermöglicht. Es birgt ein großes Potenzial, Forschern dabei zu helfen, bedeutende Durchbrüche in der Untersuchung der Niere zu erzielen, indem es Informationen wie Menge, Volumen, Verteilung und mehr der Glomeruli liefert.Zum einen untersuchen wir die Anwendung dieser Glomeruli-Markierungsmethode in der klinischen Forschung zu Nierenerkrankungen. Auf der anderen Seite werden wir weiter daran arbeiten, Methoden zur Markierung von Biotargets wie Blutgefäßen oder bestimmten Proteinen in transparenten Geweben zu verbessern und sie an unsere Forschungsbedürfnisse anzupassen.

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Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

742 Aufrufe.  Sichuan University. Das Markieren und Zählen von Glomeruli mit herkömmlichen Methoden kann kompliziert, mühsam und zeitaufwändig sein, und es sind sperrige Geräte erforderlich. Unsere Methode bietet eine sofortige und intuitiv genaue Markierungsmethode für die Analyse der Glomeruli in der gesamten Niere. Unsere Technik ist eine schnelle, einfache, genaue und kostengünstige Methode zur Analyse von Glomeruli in der gesamten Niere.Es erfordert keine spezielle Ausrüstung, so dass es in jedem Labor dur...

Serie: Autor im Rampenlicht: Unterstützung der Forschung in der Nierenbiologie durch Markierung von Glomeruli in geklärten Geweben 

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.