شارك أ.أ.ج. و م. أ. في كتابة المخطوطة جميع المؤلفين المشاركين على المخطوطة. يتم دعم MA من قبل CNRS و "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322) .A.A.J. مدعوم من قبل Fondation des Treilles و Fonds Saint-Michel و Fondation du Collège de France.

تأثير الهيكل الخلوي على الشكل النووي وديناميكيات المكثفات في بويضات الفأر

<ol>
	<li>Quinlan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Streaming+in+the+Drosophila+Oocyte.">Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte.</a> Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).</li><li>Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+perspective+on+cytoplasmic+streaming.">A physical perspective on cytoplasmic streaming.</a> Interface Focus. 5 (4), 20150030 (2015).</li><li>Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning.">Nuclear positioning.</a> Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).</li><li>Metzger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+and+kinesin-dependent+nuclear+positioning+is+required+for+skeletal+muscle+function.">MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function.</a> Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).</li><li>Roman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+repair+after+physiological+damage+relies+on+nuclear+migration+for+cellular+reconstruction.">Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction.</a> Science. 374 (6565), 355-359 (2021).</li><li>Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+nucleus+positioning+in+mouse+oocytes.">Control of nucleus positioning in mouse oocytes.</a> Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).</li><li>Brunet, S., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+vesicle+position+and+meiotic+maturation+in+mouse+oocyte.">Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte.</a> Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).</li><li>Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+markers+are+correlated+with+maturation-competence+of+human+oocytes.">Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes.</a> Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).</li><li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+diffusion+positions+the+nucleus+in+mouse+oocytes.">Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).</li><li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+fluctuations+of+the+nuclear+envelope+shape+the+transcriptional+dynamics+in+oocytes.">Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes.</a> Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).</li><li>Al Jord, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+forces+functionally+reorganize+nuclear+condensates+in+oocytes.">Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes.</a> Nat Commun. 13 (1), 5070 (2022).</li><li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), eaaf4382 (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mechanisms+of+gene+expression+control:+pre-mRNA+splicing+as+a+life+or+death+decision.">Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision.</a> Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).</li><li>Barutcu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+nuclear+domain-associated+transcripts+reveals+speckles+and+lamina+as+hubs+of+functionally+distinct+retained+introns.">Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns.</a> Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).</li><li>Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+stochastic,+motor-driven+properties+of+the+cytoplasm+using+force+spectrum+microscopy.">Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+and+chromatin+behavior+follow+MAP+kinase+activity+but+not+MPF+activity+during+meiosis+in+mouse+oocytes.">Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).</li><li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APCcdh1+activity+in+mouse+oocytes+prevents+entry+into+the+first+meiotic+division.">APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).</li><li>El-Hayek, S., Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+oocyte+growth+and+development+by+intercellular+communication+within+the+follicular+niche.">Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche.</a> Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).</li><li>Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centriole-+and+RanGTP-independent+spindle+assembly+pathway+in+meiosis+I+of+vertebrate+oocytes.">A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes.</a> J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).</li><li>Kal&#225;b, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+RanGTP-regulated+gradient+in+mitotic+somatic+cells.">Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells.</a> Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).</li><li>Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolus+as+a+multiphase+liquid+condensate.">The nucleolus as a multiphase liquid condensate.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).</li><li>Terret, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOC1R:+a+MAP+kinase+substrate+that+control+microtubule+organization+of+metaphase+II+mouse+oocytes.">DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes.</a> Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).</li><li>Dumont, J., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+FRET+to+study+RanGTP+gradients+in+live+mouse+oocytes.">Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>. OOCytes Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Carreau/OOCytes">https://github.com/Carreau/OOCytes</a> (2014)</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl">https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl</a> (2023)</li><li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+(STICS)+theory,+verification,+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells.">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).</li><li>Yi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+maintenance+of+asymmetric+meiotic+spindle+position+through+Arp2/3-complex-driven+cytoplasmic+streaming+in+mouse+oocytes.">Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>. Stowers ImageJ Plugins Available from: <a target="_blank" href="https://research.stowers.org/imagejplugins/">https://research.stowers.org/imagejplugins/</a> (2023)</li><li>Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+interscale+wavelet+denoising+of+Poisson-corrupted+images.">Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images.</a> Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).</li><li>. Ovocyte_Nucleus Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus">https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus</a> (2023)</li><li>Letort, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , (2022).</li><li>. ImageJFiles Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak">https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak</a> (2023)</li><li>Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+shape+fluctuations+of+the+cell+nucleus.">On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).</li><li>Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+fluctuations+and+coalescence+of+nucleolar+droplets+in+the+human+cell+nucleus.">Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus.</a> Phys Rev Lett. 121 (14), 148101 (2018).</li><li>Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+nuclear+shape+fluctuations+associate+with+chromatin+condensation+in+early+prophase.">Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase.</a> Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).</li><li>Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+and+cancer.">Biomolecular condensates and cancer.</a> Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).</li></ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

تشمل الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول الحقن المجهري المناسب للبويضات دون التأثير على بقائها أو وظيفتها الطبيعية9،10،11 ، بالإضافة إلى الحقن الدقيق لكميات محددة مسبقا من cRNA التي من شأنها أن تسمح بالتصور الصحيح للهياكل ذات الصلة ، مثل الب...

تحديد المواقع النووية ضروري للوظائف الخلوية والتنمويةالمتعددة 1،2،3،4،5. تعيد الخلايا الجرثومية الأنثوية في الثدييات المسماة البويضات تشكيل السيتوبلازم لوضع النواة في مركز الخلية على الرغم من خضوعها لتقسيم غير متماثل في الحجم ، والذي يعتمد على الكروموسوم اللاحق خارج المركز6 (الشكل 1). يتنبأ هذا التمركز للنواة بتطور البويضة الناجح في الفئران والبشر 7,8 ، وبالتالي إمكاناتها الجنينية (الشكل 1).
إعادة تشكيل السيتوبلازم في بويضات الفئران مدفوعة بشكل أساسي بالهيكل الخلوي للأكتوميوسين9 (الشكل 2). يولد نشاطها قوى ميكانيكية تثير النواة10 وتعيد وضعها وتخترقها (الشكل 2). وبالتالي ، فإن انتقال القوة السيتوبلازمية إلى النيوكليوبلازمية هذا يضبط ديناميكيات عضيات معالجة الحمض النووي الريبي المرسال المسمى البقع النووية11 ، وهي واحدة من عدة عضيات عديمة الغشاء في النواة تعرف باسم المكثفات الجزيئية الحيوية12،13،14،15،16 (الشكل 2).
كان التصوير الحي حاسما في فك رموز الآثار الوظيفية للتحريض النووي. ساهمت أفلام الهجرة النووية على مدار ساعات ، وكذلك أفلام الدقة الزمنية العالية لشبكة الأكتين والسيتوبلازم السائب ، إلى حد كبير في وضع نموذج نظري لتحديد المواقع النووية ، يربط بين جداول زمنية مختلفة9. أيضا ، أبرزت الأفلام ذات الدقة الزمنية العالية للسيتوبلازم والمخطط النووي والمكونات النووية مثل الكروماتين والمكثفات النووية دور التحريض القائم على الهيكل الخلوي للنواة على معالجة الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني في بويضات الفئران ، وسد المقاييس الزمانية المكانية المختلفة داخل الخلية10،11. وإجمالا، قدم هذا النهج العابر للمقياس القائم على التصوير الحي الأساس المنطقي الأول الذي يربط التحريض الخلوي الهيكلي للنواة بالنجاح التنموي للبويضات.
يوفر البروتوكول خط أنابيب التصوير وتحليل الصور المستخدم لدراسة انتقال القوى السيتوبلازمية (الناتجة بشكل أساسي عن F-actin وجزئيا عن طريق الأنابيب الدقيقة) إلى النواة ومكوناتها الداخلية في بويضات الفئران. نتيجة هذه التجارب هي التقاط سلسلة متصلة من القوى عبر المقاييس المكانية ، من الهيكل الخلوي في السيتوبلازم إلى الداخل النووي عبر أفلام عالية الدقة الزمنية كما هو موضح في دراستين حديثتين10،11 ، والتي أثبتت العلاقة بين الحركات النشطة السيتوبلازمية ، وتقلبات المخطط النووي ، وكذلك الحركة والتقلبات السطحية لنوع واحد من المكثفات الجزيئية الحيوية النووية: بقع نووية. يمكن تطبيق نفس النهج على أنظمة نموذجية أخرى حيث من المتوقع أن تتغير القوى السيتوبلازمية ، كما هو الحال في سياق الخلايا السرطانيةالخبيثة 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1-M1 spinning disk</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMI6000B microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel</td>
			<td>Sutter Instruments Roper Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software&#160;</td>
			<td>Universal Imaging,&#160;</td>
			<td></td>
			<td>version 7.7.9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OF1 and C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 3 CCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAeasy kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC35 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11826</td>
			<td>Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRSF2-GFP plasmid&#160;</td>
			<td>&#160;OriGene Technologies</td>
			<td>MG202528</td>
			<td>NM_011358</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper Micropipette</td>
			<td>&#160;XLAB Solutions</td>
			<td></td>
			<td>specialized for oocyte collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1384&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 mMessage mMachine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM13344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic chamber</td>
			<td>Life Imaging Service</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows Excel</td>
			<td>Windows</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing cytoskeleton-based agitation of the mouse oocyte nucleus across spatial scales

يتمثل أحد التحديات الرئيسية في فهم أسباب العقم عند النساء في توضيح الآليات التي تحكم تطور الخلايا الجرثومية الأنثوية ، والتي تسمى البويضات. يتميز تطورها بنمو الخلايا والانقسامات اللاحقة ، وهما مرحلتان حرجتان تعدان البويضة للاندماج مع المنوية لبدء التطور الجنيني. أثناء النمو ، تعيد البويضات تنظيم السيتوبلازم لوضع النواة في مركز الخلية ، وهو حدث ينبئ بتطور البويضة الناجح في الفئران والبشر ، وبالتالي إمكاناتها الجنينية. في بويضات الفأر ، تبين أن إعادة التنظيم السيتوبلازمي هذه مدفوعة بالهيكل الخلوي ، الذي يولد نشاطه قوى ميكانيكية تثير النواة وتعيد وضعها وتخترقها. وبالتالي ، فإن انتقال القوة السيتوبلازمية إلى النيوكليوبلازمية يضبط ديناميكيات عضيات معالجة الحمض النووي الريبي النووية المعروفة باسم المكثفات الجزيئية الحيوية. يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق تأثير الهيكل الخلوي على النواة عبر المقاييس المكانية في بويضات الفأر ، بدقة زمنية عالية. يفصل خطوات التصوير وتحليل الصور والأدوات اللازمة لتقييم أ) نشاط الهيكل الخلوي في سيتوبلازم البويضة ، ب) التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة البويضة ، و ج) تأثيراته على ديناميكيات المكثفات الجزيئية الحيوية في نوكليوبلازم البويضة. بالإضافة إلى بيولوجيا البويضات ، يمكن تكييف الطرق الموضحة هنا لاستخدامها في الخلايا الجسدية لمعالجة الضبط القائم على الهيكل الخلوي للديناميكيات النووية عبر المقاييس.

Nuclear positioning is essential for multiple cellular and developmental functions1,2,3,4,5. Mammalian female germ cells named oocytes remodel their cytoplasm to position the nucleus at the cell center despite undergoing an asymmetric division in size, which relies on subsequent chromosome off-centering6 (Figure 1). This centering of the nucleus predicts successful oocyte development in mice and humans7, 8, and thus, their embryogenic potential (Figure 1).
Cytoplasmic remodeling in mouse oocytes is driven primarily by the actomyosin cytoskeleton9 (Figure 2). Its activity generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus10 (Figure 2). Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear messenger RNA-processing organelles named nuclear speckles11, one of several membrane-less organelles in the nucleus known as biomolecular condensates12,13,14,15,16 (Figure 2).
Live imaging has been decisive in deciphering the functional implications of nuclear agitation. Movies of nuclear migration over hours, as well as high-temporal resolution movies of the actin mesh and the bulk cytoplasm, largely contributed to the elaboration of a theoretical model for nuclear positioning, linking different timescales9. Also, high temporal resolution movies of the cytoplasm, nuclear outline and nuclear components such as chromatin and nuclear condensates, highlighted the role of cytoskeleton-based agitation of the nucleus on RNA-processing and gene expression in mouse oocytes, bridging different spatiotemporal scales within the cell10,11. Altogether, such a scale-crossing approach based on live imaging provided the first rationale linking cytoskeletal agitation of the nucleus to the developmental success of oocytes.
The protocol provides the imaging and image analysis pipeline used to study the transmission of cytoplasmic forces (generated primarily by F-actin and partly by microtubules) to the nucleus and its internal components in mouse oocytes. The outcome of these experiments is to capture the continuum of forces across spatial scales, from the cytoskeleton in the cytoplasm to the nuclear interior via high temporal resolution movies as shown in two recent studies10,11, that established the link between cytoplasmic active movements, fluctuations of the nuclear outline, as well as movement and surface fluctuations of a single type of nuclear biomolecular condensates: nuclear speckles. The same approach may be applied to other model systems where cytoplasmic forces are expected to change, such as in the context of malignant cancer cells17.

تسليط الضوء على المؤلف: توضيح ديناميات النقل الميكانيكي والتحريض النووي في بويضات الفئران

التقاط التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة بويضة الفأر عبر المقاييس المكانية

The lab aims to better understand the mechanisms involved in the acquisition of female gamut quantity, which is essential for the reproduction of sexual species using the mouse oocytes model system. Recently, we identified a novel mechanical transduction process that promotes agitation of the nucleus and its content, leading to the fine regulation of maternal RNAs in mouse oocytes. The imaging and image analysis pipeline presented in this protocol allows us to highlight the transmission of cytoskeletal forces as a continuum across scales from the cytoplasm to the nucleus and its components, including nuclear RNA processing bodies in mouse oocytes.This protocol provides simple tools that allow us to address first transmission across multiple cellular scales in a single pipeline for the first time. Complemented with biophysical modeling, this protocol constitutes a non-invasive technique to address changes in nuclear mechanics and the dissipation of energy across cellular compartments.

تظهر لوحات الصور في الشكل 3 أمثلة على بويضة نموذجية كاملة النمو (الشكل 3 أ) ، وبلازما النواة في خلية بيضية كاملة النمو تعبر عن YFP-Rango (الشكل 3B) ، وبلازما النواة في خلية بيضية كاملة النمو تعبر عن صحيح (اللوحة اليسرى ؛ الشكل 3 ج) أو م...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Elucidating the Dynamics of Mechano-Transduction and Nuclear Agitation in Mouse Oocytes at JoVE.com

يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق التأثير المادي للهيكل الخلوي على الشكل النووي والعضيات الداخلية الخالية من الغشاء في نظام بويضات الفأر. يمكن تكييف الإطار للاستخدام في أنواع الخلايا والسياقات الأخرى.

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

يهدف المختبر إلى فهم أفضل للآليات التي ينطوي عليها اكتساب كمية التدرج الأنثوي ، وهو أمر ضروري لتكاثر الأنواع الجنسية باستخدام نظام نموذج بويضات الفئران. في الآونة الأخيرة ، حددنا عملية نقل ميكانيكية جديدة تعزز إثارة النواة ومحتواها ، مما يؤدي إلى التنظيم الدقيق للحمض النووي الريبي للأمهات في بويضات الفئران. يسمح لنا خط أنابيب التصوير وتحليل الصور المقدم في هذا البروتوكول بتسليط الضوء على انتقال قوى الهيكل الخلوي كسلسلة متصلة عبر المقاييس من السيتوبلازم إلى النواة ومكوناتها ، بما في ذلك أجسام معالجة الحمض النووي الريبي النووي في بويضات الفئران.يوفر هذا البروتوكول أدوات بسيطة تسمح لنا بمعالجة الإرسال الأول عبر نطاقات خلوية متعددة في خط أنابيب واحد لأول مرة. ويشكل هذا البروتوكول، الذي يكمله النمذجة الفيزيائية الحيوية، تقنية غير جراحية لمعالجة التغيرات في الميكانيكا النووية وتبديد الطاقة عبر الأجزاء الخلوية.

capturing-cytoskeleton-based-agitation-mouse-oocyte-nucleus-across

Research

JoVE Journal

Biology

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

505 Views.  Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL. يهدف المختبر إلى فهم أفضل للآليات التي ينطوي عليها اكتساب كمية التدرج الأنثوي ، وهو أمر ضروري لتكاثر الأنواع الجنسية باستخدام نظام نموذج بويضات الفئران. في الآونة الأخيرة ، حددنا عملية نقل ميكانيكية جديدة تعزز إثارة النواة ومحتواها ، مما يؤدي إلى التنظيم الدقيق للحمض الن?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: توضيح ديناميات النقل الميكانيكي والتحريض النووي في بويضات الفئران

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named oocytes. Their development is marked by cell growth and subsequent divisions, two critical phases that prepare the oocyte for fusion with sperm to initiate embryogenesis. During growth, oocytes reorganize their cytoplasm to position the nucleus at the cell center, an event predictive of successful oocyte development in mice and humans and, thus, their embryogenic potential. In mouse oocytes, this cytoplasmic reorganization was shown to be driven by the cytoskeleton, the activity of which generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus. Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear RNA-processing organelles known as biomolecular condensates. This protocol provides an experimental framework to document, with high temporal resolution, the impact of the cytoskeleton on the nucleus across spatial scales in mouse oocytes. It details the imaging and image analysis steps and tools necessary to evaluate i) cytoskeletal activity in the oocyte cytoplasm, ii) cytoskeleton-based agitation of the oocyte nucleus, and iii) its effects on biomolecular condensate dynamics in the oocyte nucleoplasm. Beyond oocyte biology, the methods elaborated here can be adapted for use in somatic cells to similarly address cytoskeleton-based tuning of nuclear dynamics across scales.

This protocol provides an experimental framework to document the physical impact of the cytoskeleton on nuclear shape and the internal membrane-less organelles in the mouse oocyte system. The framework can be adapted for use in other cell types and contexts.