تم دعم التطوير الأولي لنظام الاستزراع منخفض التهوية جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (CRI-OA-1416690 إلى كلية ديكنسون). تفضلت الدكتورة لورين مولينو بتوفير مرافق المختبرات في معهد وودز هول لعلوم المحيطات ، حيث تم جمع البيانات المقدمة لهذا النظام (الشكل 4).

1. المناورات الروتينية لإنشاء والحفاظ على مزارع اليرقات من C. fornicata
ملاحظة: تبدأ هذه الطريقة بوعاء جالون (3.8 لتر) من مياه البحر يحتوي على C. fornicata البالغة التي أطلقت للتو يرقات veliger الحضنة. يمكن جمع البالغين ميدانيا أو الحصول عليها من مورد مذكور في جدول المواد. البالغون هم خنثى بروتاندروس يعيشون في مداخن التزاوج مع إناث حاضنة لاطئة في قاع المكدس. لا تفتت أكوام الكبار. تم وصف موسمية التكاثر وطرق تكييف البالغين للتفريخ خارج الموسمسابقا 17. من الأفضل جمع اليرقات في غضون 2-3 ساعات بعد إطلاقها عندما تكون سلبية بقوة وستركز بالقرب من سطح الجرة.
<ol><li>اصنع غربالا عن طريق قطع الجزء السفلي من دورق بلاستيكي ثلاثي الزوايا سعة 400 مل يمكن التخلص منه واللصق على لوحة من شبكة نايلون 236 ميكرومتر. لهذا الغرض وخاصة لبناء mesocosm (أدناه) ، استخدم غراء تذوب ساخنا تمت صياغته من أجل الالتصاق جيد بالبولي إيثيلين.</li>
	<li>قم بإزالة التهوية من الجرة البالغة واتركها لمدة 15-20 دقيقة حتى يستقر الحطام ويمكن لليرقات السباحة بسهولة إلى السطح.</li>
	<li>قم بسحب اليرقات من خلال أنبوب زجاجي قصير الطول (15-20 سم) من 5 مم مثبت في نهاية أنبوب حوض السمك البلاستيكي الناعم بطول 60-80 سم في الغربال المحضر أعلاه ، معلقا في دورق زجاجي سعة 600 مل بحيث تفيض مياه البحر الزائدة على الدورق الزجاجي بينما يتم الاحتفاظ باليرقات على الغربال. الحفاظ على الجزء السفلي من الغربال تحت الماء وتجنب تقطعت بهم السبل اليرقات.</li>
	<li>ارفع الغربال لفترة وجيزة من الدورق واستخدم زجاجة بخ من مياه البحر المفلترة (FSW) لشطف اليرقات في وعاء زجاجي من FSW بحجم مناسب للتلاعب به تحت مجهر تشريح منخفض الطاقة. ملاحظة: تزدهر يرقات C. fornicata في مياه البحر الطبيعية المفلترة بالقرب من 30 جزء في المليون من الملوحة أو مياه البحر الاصطناعية الفورية للمحيطات التي تصل إلى 32 جزء في الألف. الملوحة ، عند 20-25 درجة مئوية17،18. الترشيح عند < 1 ميكرومتر يكفي للقضاء على الطلائعيات الوبائية الملوثة التي يمكن أن تسبب مشاكل في الثقافات المختبرية.</li>
	<li>قم بنقل وحساب العدد المطلوب من اليرقات يدويا في جرة استزراع باستخدام ماصة باستور. للحصول على أفضل النتائج، استخدم حجم مزرعة 1 يرقة/5 مل لبكتيريا C. fornicata. عد اليرقات وتجنب إغراء تقدير الأعداد.</li>
	<li>تغذية اليرقات بالحصة المرغوبة من الطحالب الدقيقة عند بدء الاستزراع واستبدال الطحالب الدقيقة كل يوم عند استبدال مياه الاستزراع. ملاحظة: اتباع نظام غذائي من 1 × 105 خلايا / مل Isochrysis galbana (سلالة T-ISO) هو نظام غذائي قياسي جيد ينتج عنه معدلات نمو معملية شبه قصوى. تم توفير الحصص الغذائية وطرق ثقافة T-ISO في منشور سابق17.</li>
	<li>قم بتغيير ماء الاستزراع كل يومين عن طريق سكب محتويات المستنبتة في غربال داخل دورق ، كما في الخطوة 1.3 أعلاه. ارفع الغربال واستخدم زجاجة بخ من FSW لشطف اليرقات في جرة استزراع من FSW الطازج مع طعام جديد. ملاحظة: أفضل الممارسات هي فصل أي أواني زجاجية تستخدم في استزراع اليرقات وتجنب أي اتصال لتلك الأواني الزجاجية بالمثبتات أو أملاح المعادن الثقيلة القابلة للذوبان أو المنظفات. من الأفضل القيام بالتنظيف الروتيني باستخدام عجينة من صودا الخبز (NaHCO3) ووسادة تنظيف من النايلون ، بينما يمكن إزالة الرواسب المعدنية بغسل حمض خفيف في الخل الأبيض أو حمض الهيدروكلوريك المخفف.</li>
</ol>2. بناء مزارع جيدة التهوية ليرقات C. fornicata
ملاحظة: يحتوي الجرة الزجاجية الموصى بها (جدول المواد) على غطاء من مادة البولي بروبيلين ، وهو خامل لمياه البحر وله سمك مناسب لتثبيت مداخل الأنابيب الشائكة لتيار غاز التهوية.
<ol><li>قم بحفر فتحتين مقاس 5 مم في غطاء كل جرة ثقافة (بما في ذلك البطانة الداخلية للغطاء) ، كل منهما على بعد حوالي 1.5 سم من الحافة ومقابل بعضهما البعض. (مثقاب ميكانيكي إمبراطوري مقاس 13/64 بوصة أو # 7 ASME قياسي سيجعل أيضا فتحة خلوص مناسبة).</li>
	<li>قم بتركيب محول أنابيب نايلون ملولب 1/8 بوصة × 10-32 في كل فتحة ، باستخدام صامولة نايلون 10-32 ، مع شوكة الأنبوب على السطح الخارجي للغطاء.</li>
	<li>ضع القليل من مانع التسرب المطاطي السيليكوني على فتحة الجزء الداخلي الملولب لأحد محولات الأنابيب وادفع أنبوب البولي إيثيلين بطول 20 سم من 2 مم (القطر الخارجي) عبر الفتحة من الداخل بحيث يبرز بضعة مم خارج الفتحة الخارجية لشوكة الأنبوب.</li>
	<li>سيحتوي الأنبوب الآن على سدادة صغيرة من مادة مانعة للتسرب في نهاية الحوض تبرز من خلال شوكة الأنبوب ، لكن الأنابيب الشفافة ستكون مرئية بعد نهاية الشوكة مباشرة. دع المادة المانعة للتسرب تعالج ، ثم قم بقص الطرف البارز لأنبوب البولي إيثيلين بحيث يكون متدفقا مع نهاية شوكة الأنبوب.</li>
	<li>املأ جرة الاستزراع ب FSW في حدود 1 سم من الكتف في الجزء العلوي من الجرة ، وقم بربط الغطاء لأسفل ، وقم بتوصيل هواء التهوية أو إمداد مزيج الغاز التجريبي بشوكة الأنبوب التي تحمل أنبوب تهوية البولي إيثيلين. قم بقص طول أنبوب التهوية بحيث تقع نهايته بدقة في أسفل الجرة.</li>
	<li>اضبط تدفق الهواء أو مزيج الغاز للتهوية لإنتاج تيار بطيء من الفقاعات (الشكل 1). استخدم مضخة هواء حوض السمك مع صمامات عصابة حوض السمك الشائعة لتزويد التهوية بالهواء المحيط أو استخدم وحدات التحكم في التدفق الشامل لخلطات غازات الغلاف الجوي التجريبية الأخرى14.</li>
</ol>3. بناء مستزرع ميزوكوزم قابل للنشر الميداني ليرقات C. fornicata
<ol><li>قطع 4 فتحات مستطيلة متباعدة بشكل متساو ، كل منها 25 سم × 14.5 سم ، في جوانب دلو قياسي من البولي إيثيلين سعة 7 جالون. ضع الجزء السفلي من كل فتحة على بعد حوالي 3.5 سم من الجزء السفلي الداخلي للدلو (الشكل 2 أ). يعتبر منشار السيف الكهربائي المحمول باليد بشفرة ذات أسنان دقيقة مثاليا لهذا الغرض. احتفظ بقطع النفايات المقطوعة وقم بتقطيعها بالطول إلى شرائح بعرض 2 سم باستخدام منشار طاولة.</li>
	<li>قم بقطع 4 ألواح من شبكة نايلون 236 ميكرومتر ، كل منها لا يقل عن 30 سم × 20 سم ، وذلك لتداخل بشكل مريح (بمقدار 2 سم على الأقل) فتحات القطع في الجرافة. قم بتأمين حافة واحدة من اللوحة الشبكية مؤقتا على حافة طويلة من الفتحة باستخدام مشابك زنبركية صغيرة أو مشابك غسيل.</li>
	<li>قم بلصق حافة اللوحة الشبكية بفتحة الجرافة باستخدام غراء تذوب ساخن مصمم للبولي إيثيلين. بمجرد تثبيت الحافة الأولى ، قم بلصق الحواف الأخرى مع الحفاظ على التوتر للحصول على سطح مشدود على اللوحة الشبكية.</li>
	<li>قم بقص أطوال شرائط قطع نفايات الجرافة من الخطوة 3.1 ، لعمل شرائط تقوية لتغطية المنطقة الملصقة بدقة حيث تتداخل الألواح الشبكية مع فتحات الجرافة. اضغط على كل شريط تغطية في مكانه بكمية كبيرة من الغراء الذائب الساخن ، واعمل بسرعة لوضع كل شريط في مكانه قبل أن يصلب الغراء.</li>
	<li>قم بتأمين نهاية كل شريط باستخدام برشام ستار من النايلون مثبت من خارج الجرافة. تقليم الغراء الزائد وشبكة من الحواف الخارجية لشرائط التسليح بسكين الحلاقة فائدة. ملاحظة: يتطلب كل برشام فتحة تجريبية مقاس 15/64 بوصة. تظهر الأجزاء الداخلية (العمياء) من المسامير داخل الميزوكوزم النهائي في الشكل 2 ب.</li>
	<li>انشر mesocosm في رف عائم يحمل الجزء العلوي من الدلو فوق الماء جيدا (الشكل 2C). الرف العائم الموضح مصنوع من شرائح 30 سم من أنابيب PVC 2 بوصة Schedule 40 ، مثبتة مع وصلات الكوع ونقطة الإنطلاق لإنشاء هيكل محكم الإغلاق يمكنه استيعاب صف من 4 mesocosms مكررة.</li>
	<li>اعتمادا على الظروف المحلية ، قد تصبح الألواح الشبكية فاسدة في غضون 1-2 أيام ، بطريقة تعيق تبادل مياه البحر عبر الميزوكوزم. إلى الحد الذي يحدث فيه هذا ، انقل اليرقات إلى ميزوكوزم نظيف طازج عن طريق سحب الميزوكوزم الملوث 2/3من الماء والإنقاذ بشكل متكرر من قاعه إلى الميزوكوزم الطازج باستخدام إبريق سعة 2 لتر.</li>
	<li>قم بإجراء 20-25 تكرارا لنقل معظم اليرقات ، أو حتى لا يتم ملاحظة اليرقات في الميزوكوزم الملوث. نظف الميزوكوزم الملوث عن طريق فرك الألواح الشبكية برفق باستخدام إسفنجة ناعمة محملة بعجينة من صودا الخبز (NaHCO3) وشطفها بماء الصنبور.</li>
</ol>

استزراع يرقات كريبيدولا فورنيكاتا في الظروف المختبرية والحقلية

<ol>
	<li>Conklin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryology+of+Crepidula:+a+contribution+to+the+cell+lineage+and+early+development+of+some+marine+gastropods.">The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods.</a> Gasteropods. , (1897).</li><li>Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slipper+snail,+Crepidula:+an+emerging+lophotrochozoan+model+system.">The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li><li>Lyons, D. C., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slipper+snail+tales:+how+Crepidula+fornicata+and+Crepidula+atrasolea+became+model+molluscs.">Slipper snail tales: how Crepidula fornicata and Crepidula atrasolea became model molluscs.</a> Curr Top Dev Biol. 147, 375-399 (2022).</li><li>Blanchard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata+(L.+1758)+in+Europe.+Current+state+and+consequences.">Spread of the slipper limpet Crepidula fornicata (L. 1758) in Europe. Current state and consequences.</a> ScientiaMarina. 61 (Suppl 2), 109-118 (1997).</li><li>Beninger, P., Valdizan, A., Decottigies, P., Cognie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+reproductive+dynamics+of+the+invasive+slipper+limpet,+Crepidula+fornicata.">Field reproductive dynamics of the invasive slipper limpet, Crepidula fornicata.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 390 (2), 179-187 (2010).</li><li>Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+temperature,+growth+rate,+and+duration+of+planktonic+life+for+larvae+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.).">The relationship between temperature, growth rate, and duration of planktonic life for larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 74 (3), 241-257 (1984).</li><li>Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+effects:+surprising+consequences+of+embryonic+and+larval+experience+on+life+after+metamorphosis.">Latent effects: surprising consequences of embryonic and larval experience on life after metamorphosis.</a> Evol Ecol Marine Invertebrate Larvae. , 208-225 (2018).</li><li>Pechenik, J. A., Gee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+metamorphic+competence+in+larvae+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.),+judged+by+a+natural+and+an+artificial+cue.">Onset of metamorphic competence in larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.), judged by a natural and an artificial cue.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 167 (1), 59-72 (1993).</li><li>Taris, M., Comtet, T., Viard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+function+of+nitric+oxide+on+the+onset+of+metamorphosis+in+competent+larvae+of+Crepidula+fornicata:+A+transcriptional+perspective.">Inhibitory function of nitric oxide on the onset of metamorphosis in competent larvae of Crepidula fornicata: A transcriptional perspective.</a> Mar Genomics. 2 (3-4), 161-167 (2009).</li><li>Penniman, J. R., Doll, M. K., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+correlates+of+settlement+in+veliger+larvae+of+the+gastropod,+Crepidula+fornicata.">Neural correlates of settlement in veliger larvae of the gastropod, Crepidula fornicata.</a> Invertebrate Biol. 132 (1), 14-26 (2013).</li><li>Meyer-Kaiser, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carryover+effects+of+brooding+conditions+on+larvae+in+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata.">Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata.</a> Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).</li><li>Noisette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+encapsulation+protect+embryos+from+the+effects+of+ocean+acidification?+The+example+of+Crepidula+fornicata.">Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata.</a> PLoS One. 9 (3), e93021 (2014).</li><li>Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilience+of+Atlantic+slippersnail+Crepidula+fornicata+larvae+in+the+face+of+severe+coastal+acidification.">Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification.</a> Front in Mar Sci. 5, 312 (2018).</li><li>Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legacy+of+multiple+stressors:+Responses+of+gastropod+larvae+and+juveniles+to+ocean+acidification+and+nutrition.">Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition.</a> Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).</li><li>Pechenik, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ocean+acidification+on+growth,+onset+of+competence,+and+perception+of+cues+for+metamorphosis+in+larvae+of+the+slippershell+snail,+Crepidula+fornicata.">Impact of ocean acidification on growth, onset of competence, and perception of cues for metamorphosis in larvae of the slippershell snail, Crepidula fornicata.</a> Mar Biol. 166, 128 (2019).</li><li>Reyes, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marine+gastropod+Crepidula+fornicata+remains+resilient+to+ocean+acidification+across+two+life+history+stages.">The marine gastropod Crepidula fornicata remains resilient to ocean acidification across two life history stages.</a> Front Physiol. 12, 702864 (2021).</li><li>Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+seawater+culture+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+for+studies+of+larval+settlement+and+metamorphosis.+In:+Carroll,+D.,+Stricker,+S.+(eds)+Developmental+biology+of+the+sea+urchin+and+other+marine+invertebrates.">Artificial seawater culture of the gastropod Crepidula fornicata for studies of larval settlement and metamorphosis. In: Carroll, D., Stricker, S. (eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates.</a> Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).</li><li>Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interactive+influence+of+temperature+and+salinity+on+larval+and+juvenile+growth+in+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.).">The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).</li><li>Strathmann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae. , (1987).</li><li>Clark, H. R., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+fluctuations+in+CO2+and+dissolved+oxygen+concentrations+do+not+provide+a+refuge+from+hypoxia+and+acidification+for+early-life-stage+bivalves.">Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves.</a> Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114 (2016).</li><li>Gobler, C. J., Baumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+acidification+in+ocean+ecosystems:+coupled+dynamics+and+effects+on+marine+life.">Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life.</a> Biol Lett. 12 (5), 20150976 (2016).</li><li>Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+larval+and+juvenile+growth+rates+in+two+marine+gastropods,+Crepidula+plana+and+C.">Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C.</a> fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).</li><li>Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+food+on+metamorphic+competence+in+the+model+system+Crepidula+fornicata.">Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata.</a> Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).</li><li>Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coastal+ocean+acidification:+the+other+eutrophication+problem.">Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem.</a> Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).</li></ol>

لا يوجد تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

على الرغم من أن يرقات C. fornicata سهلة نسبيا للاستزراع مقارنة باليرقات البحرية الأخرى ذات التغذية العوالق، إلا أن الاهتمام بأساسيات ممارسة الاستزراع الجيد لا يزال ضروريا17،19. يجب أن تبدأ اليرقات السليمة في التغذية مباشرة بعد الفقس. يمكن التحقق من ذلك بسهول...

يتم تمثيل النعال ، Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae) ، بشكل جيد في الأدبيات البحثية الحالية والتاريخية بسبب فائدته كنموذج تنموي وبسبب تأثيراته الواسعة النطاق كنوع غازي. كان بمثابة مثال تأسيسي للتطور الحلزوني في العصر الكلاسيكي لعلم الأجنة التجريبي1 وشهد ولادة جديدة للاهتمام مع تطبيق أدوات التصوير والجينوم الحديثة لتشريح آليات التطور المبكر lophotrochozoan 2,3. في الطرف الآخر من تاريخ حياتها ، ركزت تحقيقات أخرى على تأثيرات السكان البالغين لمهندس النظام البيئي هذا في البيئات البحرية الساحلية المعتدلة البعيدة عن توزيعها الأصلي في شرق أمريكا الشمالية 4,5. بين الجنين والبالغ ، كانت يرقات veliger من هذا النوع موضوع العديد من الدراسات حول تطور اليرقات والبيئة ، وخاصة العوامل التي تؤثر على النمو واكتساب الكفاءة للتحول ، والإشارات الداخلية والخارجية التي تتوسط استقرار اليرقات ، وآثار تجربة اليرقات على أداء الأحداث6،7،8،9،10،11. كشفت الدراسات الحديثة عن مرونة يرقات وصغار C. fornicata لتحمض المحيطات ، وهو وسيلة أخرى للاستخدام البحثي المنتج لهذا12،13،14،15،16.
من مزايا C. fornicata لدراسات بيولوجيا اليرقات البحرية أنه من السهل نسبيا أن تنمو في المختبر في مياه البحر الطبيعية أو الاصطناعية على نظام غذائي unialgal من السوط Isochrysis galbana. تم تفصيل أساليب الثقافة من قبل المؤلف في منشور مطبوع سابق يركز على الأساليب17. وأسباب هذه المساهمة ذات شقين. أولا ، المناورات الجسدية الروتينية التي ينطوي عليها إنشاء الثقافات والعناية بها بسيطة للغاية من الناحية المفاهيمية ولكن من الصعب إجراؤها بشكل صحيح دون التدريب العملي أو عرض الفيديو. ثانيا، تم وصف نوعين مختلفين عن طرق الاستزراع الموصوفة سابقا وهما مناسبان بشكل خاص للدراسات المختبرية والميدانية للاستجابات للضغوط البيئية مثل تحمض المحيطات، والتخثث، واستنفاد الأكسجين. أولها نظام استزراع منخفض الحجم (800 مل) مناسب لمعالجة الأس الهيدروجيني والأكسجين المذاب في مياه البحر عبر كميات صغيرة من الغازات الفقاعية ، والثاني هو نظام ميزوكوزم أكبر حجما (15 لتر) يمكن وضعه في الحقل ويسمح بالتبادل الحر لمياه البحر المحيطة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bucket, Polyethylene, 7 gallon</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>16916</td>
			<td>for mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crepidula fornicata</td>
			<td>Marine Biological Laboratory, Marine Resources Center</td>
			<td>760</td>
			<td>adult broodstock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotmelt glue, Infinity Supertac 500</td>
			<td>Hotmelt.com</td>
			<td>INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB</td>
			<td>good for bonding polyethylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar, glass, 32 oz, with polypropylene lid</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-19316P-W</td>
			<td>for 800 mL ventilated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh, 236 &#181;m</td>
			<td>Dynamic Aqua Supply Ltd.</td>
			<td>NTX236-136</td>
			<td>for mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, hex, nylon, 10-32 thread</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>1004554441</td>
			<td>for fastening tubing barbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivets, nylon, blind, 15/64&#34; diameter, 5/32&#34;-5/16&#34; grip range, pack of 8</td>
			<td>NAPA auto parts</td>
			<td>BK 6652844</td>
			<td>4 packs needed per mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing barb 1/8&#34; x 10-32 thread</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65593</td>
			<td>2 needed per culture jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, polyethylene, 2.08 mm OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11G</td>
			<td>for ventilating gas stream inside culture jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Tygon, 1/8&#34;x3/16&#34;x1/32&#34;</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>57810</td>
			<td>fits barbs for ventilating cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory and field culture of larvae of the slipper limpet, crepidula fornicata

تم استخدام رخويات بطنيات الأرجل كاليبتريد، Crepidula fornicata، على نطاق واسع لدراسات علم الأحياء التنموي لليرقات، وعلم وظائف الأعضاء، والبيئة. تم جمع يرقات القطيفة الحاضنة من هذا النوع عن طريق السحب على غربال بعد الإطلاق الطبيعي من قبل البالغين ، وتوزيعها في المستزرع بكثافة 200 / لتر ، وتغذيتها ب Isochrysis galbana (سلالة T-ISO) عند 1 × 105 خلايا / مل. تم توثيق نمو القشرة واكتساب الكفاءة للتحول لليرقات الشقيقة التي تمت تربيتها في مزارع 800 مل جيدة التهوية مصممة لتحقيق التوازن مع الهواء المحيط أو لمخاليط غازات الغلاف الجوي المحددة. على النقيض من ظروف الثقافة المختبرية هذه ؛ كما تم جمع بيانات النمو والكفاءة لليرقات التي تمت تربيتها في ميزوكوزم مياه البحر المحيطة المتدفقة بسعة 15 لترا والتي تقع في مجموعة حقلية من البالغين الناضجين المتكاثرين. كانت معدلات النمو وتوقيت الكفاءة المتحولة في الثقافات المختبرية مماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات المنشورة سابقا. نمت اليرقات التي تربى في حقل mesocosm بشكل أسرع بكثير وتحولت في وقت أقرب مما تم الإبلاغ عنه في أي دراسات معملية. هذه الطرق معا مناسبة لاستكشاف تطور اليرقات في ظل ظروف مضبوطة محددة مسبقا في المختبر وكذلك في ظل الظروف التي تحدث بشكل طبيعي في الحقل.

The slipper limpet, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), is well-represented in current and historical research literature because of its utility as a developmental model and because of its widespread impacts as an invasive species. It served as a foundational example of spiralian development in the classic age of experimental embryology1 and has experienced a rebirth of interest with the application of modern imaging and genomic tools to dissect mechanisms of lophotrochozoan early development2,3. At the other end of its life history, other investigations have focused on the impacts of adult populations of this ecosystem engineer in temperate coastal marine environments far removed from its original distribution in eastern North America4,5. In between embryo and adult, the veliger larvae of this species have been subjects of numerous studies of larval development and ecology, especially of factors influencing growth and acquisition of competence for metamorphosis, the internal and external cues mediating larval settlement, and the effects of larval experience on juvenile performance6,7,8,9,10,11. Recent studies have revealed the resilience of larvae and juveniles of C. fornicata to ocean acidification, yet another avenue for productive research use of this animal12,13,14,15,16.
An advantage of C. fornicata for studies of marine larval biology is that it is relatively easy to grow in the laboratory in natural or artificial seawater on a unialgal diet of the flagellate Isochrysis galbana. Culture methods have been detailed by the author in an earlier methods-focused print publication17. The reasons for the present contribution are twofold. First, the routine physical maneuvers involved in establishing and caring for cultures are conceptually very simple but difficult to perform correctly without hands-on or video demonstration. Second, two variations on previously described culture methods are described that are especially suited to laboratory and field studies of responses to environmental stressors such as ocean acidification, eutrophication, and oxygen depletion. The first of these is a low-volume (800 mL) culture system suited for manipulation of pH and dissolved oxygen in seawater via small volumes of bubbled gases, and the second is a larger volume (15 L) mesocosm system that can be placed in the field and that allows free exchange of ambient seawater.

تسليط الضوء على المؤلف: سد الفجوة بين الملاحظات الميدانية والتلاعب المختبري في أبحاث بيئة اليرقات

الاستزراع المختبري والميداني ليرقات النعال ، Crepidula fornicata

I'm interested in how the development of marine larvae is influenced by multiple environmental factors and stressors and how the larval nervous system integrates information from the environment to regulate settlement of larvae, metamorphosis to benthic juveniles, and recruitment into adult populations. Larvae of some marine species like the Slipper Limpet, Crepidula Fornicata, are quite resilient to ocean acidification, but there are important interactions between acidification and other factors, like nutrition and salinity. We don't know very much about how larvae grow, develop, and behave in nature.Field mesocosm observations can fill in some of these gaps and suggest hypotheses to test with lab manipulations. We can begin to ask on neurobehavioral, developmental, and transcriptional levels how larvae deal with stressors that vary on short time scales in productive coastal environments that are especially susceptible to human impacts.

تم قياس نمو اليرقات واكتساب الكفاءة للتحول في 4 تكرارات متزامنة من 800 مل من المستنبتات المهواة ، كل منها يحتوي على 160 يرقة ، مشتقة من مجموعة شقيقة من اليرقات التي فقست من كتلة بيضة واحدة والتي تم تغذيتها Isochrysis galbana بكثافة 1 × 105 خلايا / مل. كان الرقم الهيدروجيني 7.9-8.0 ، وكانت درجة الحر?...

Read this Scientific Article Protocol about Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata at JoVE.com

وتعرض الورقة طرقا لاستزراع يرقات بطنيات الأقدام Crepidula fornicata في نظام صغير الحجم على نطاق مختبري وفي نظام mesocosm لمياه البحر المحيطة يمكن نشره في الميدان.

The calyptraeid gastropod mollusk, Crepidula fornicata, has been widely used for studies of larval developmental biology, physiology, and ecology. Brooded ...

أنا مهتم بكيفية تأثر تطور اليرقات البحرية بالعديد من العوامل البيئية والضغوطات وكيف يدمج الجهاز العصبي لليرقات المعلومات من البيئة لتنظيم استقرار اليرقات ، والتحول إلى الأحداث القاعية ، والتجنيد في المجموعات البالغة. يرقات بعض الأنواع البحرية مثل Slipper Limpet ، Crepidula Fornicata ، مرنة تماما لتحمض المحيطات ، ولكن هناك تفاعلات مهمة بين التحمض وعوامل أخرى ، مثل التغذية والملوحة. لا نعرف الكثير عن كيفية نمو اليرقات وتطورها وسلوكها في الطبيعة.يمكن لملاحظات mesocosm الميدانية ملء بعض هذه الفجوات واقتراح فرضيات لاختبارها مع التلاعب المختبري. يمكننا أن نبدأ في السؤال على المستويات السلوكية العصبية والتنموية والنسخية عن كيفية تعامل اليرقات مع الضغوطات التي تختلف على نطاقات زمنية قصيرة في البيئات الساحلية المنتجة المعرضة بشكل خاص للتأثيرات البشرية.

laboratory-field-culture-larvae-slipper-limpet-crepidula

Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata

224 Views.  Dickinson College. أنا مهتم بكيفية تأثر تطور اليرقات البحرية بالعديد من العوامل البيئية والضغوطات وكيف يدمج الجهاز العصبي لليرقات المعلومات من البيئة لتنظيم استقرار اليرقات ، والتحول إلى الأحداث القاعية ، والتجنيد في المجموعات البالغة. يرقات بعض الأنواع البحرية مثل Slipper Limpet ، Crepidula Fornicata ، ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: سد الفجوة بين الملاحظات الميدانية والتلاعب المختبري في أبحاث بيئة اليرقات

The calyptraeid gastropod mollusk, Crepidula fornicata, has been widely used for studies of larval developmental biology, physiology, and ecology. Brooded veliger larvae of this species were collected by siphoning onto a sieve after natural release by adults, distributed into the culture at a density of 200/L, and fed with Isochrysis galbana (strain T-ISO) at 1 x 105 cells/mL. Shell growth and acquisition of competence for metamorphosis were documented for sibling larvae reared in ventilated 800 mL cultures designed for equilibration to ambient air or to defined atmospheric gas mixtures. Contrasting with these laboratory culture conditions; growth and competence data were also collected for larvae reared in a 15 L flow-through ambient seawater mesocosm located in a field population of reproductive adults. Growth rates and timing of metamorphic competence in the laboratory cultures were similar to those reported in previously published studies. Larvae reared in the field mesocosm grew much faster and metamorphosed sooner than reported for any laboratory studies. Together, these methods are suited for exploring larval development under predetermined controlled conditions in the laboratory as well as under naturally occurring conditions in the field.

The paper presents methods for larval culture of the gastropod Crepidula fornicata in a small-volume laboratory-scale system and in an ambient-seawater mesocosm system that can be deployed in the field.

Collection of Larvae of Crepidula fornicata for Laboratory and Field Cultures

To begin, stop the aeration of the jar containing the adult Crepidula fornicata. Let the jar stand for 15 to 20 minutes to allow for debris sedimentation. Next, fix a short length of five millimeter wide glass tubing to a soft plastic aquarium tubing.Once the larvae swim up, place a sieve over a 600 milliliter glass beaker, then siphon the larvae through the tubing into the sieve. Lift the sieve briefly, invert it and squirt filtered sea water on the bottom of the sieve to rinse the larvae into a glass bowl with filtered sea water.

مجموعة يرقات كريبيدولا فورنيكاتا للثقافات المختبرية والحقلية

Construction of Ventilated Cultures for Larvae of Crepidula fornicata

To begin, drill two five millimeter holes in lid of jar. Install a tubing barb in each hole using a 10-32 nylon nut. Apply a dab of silicone rubber aquarium sealant on the aperture of the threaded inner portion of a tubing barb.Push a 20 centimeter long, two millimeter wide polyethylene tubing through the aperture. Allow the sealant at the end of the tubing to cure, then trim the protruding end, so that it is flush with the end of the tubing barb.

بناء مزارع جيدة التهوية ليرقات كريبيدولا فورنيكاتا

Setup and Routine Maintenance of Laboratory Cultures of Crepidula fornicata

To begin, place a glass bowl containing the larvae of Crepidula fornicata on the stage of a dissecting microscope. With a Pasteur pipette, manually transfer and count the desired number of larvae into a culture jar containing filtered sea water. Feed the larvae with an appropriate volume of microalgae.Add filtered sea water to bring the culture volume to within one centimeter of the shoulder of the jar. Screw down the lid of culture jar and connect the ventilation air supply to the barb fitting on the tubing leading to the jar's bottom. Use an aquarium air pump with common aquarium gang valves to supply ventilation with ambient air.Then adjust the air flow to yield a steady, slow stream of bubbles. To replace the culture water, pour the contents of the jar into a sieve over a beaker. Invert the sieve over the culture jar containing fresh, filtered sea water, then use a squirt bottle of filtered sea water to rinse the larvae into the jar.Add some microalgae as feed for the larvae and top off the jar with filtered sea water to within one centimeter of the jar's shoulder. The larvae of Crepidula fornicata appear to grow slower in the laboratory cultures relative to the mesocosm cultures. The larvae started to metamorphos by day eight, and were all competent for metamorphosis by day 12.

الإعداد والصيانة الروتينية للمزارع المختبرية ل Crepidula fornicata

Field-Deployable Mesocosm Culture of the Larvae of Crepidula fornicata

To begin, use a handheld electric saber saw to cut four evenly spaced rectangular openings into the sides of a standard 7 gallon polyethylene bucket. With a table saw, slice the cutout pieces lengthwise into 2 centimeter wide strips. Cut out four panels of nylon mesh to overlap the cutout openings of the bucket.Temporarily secure one edge of a mesh panel over the long edge of a cutout with small spring clamps. Now glue the edge of the mesh panel to the bucket opening with hot glue. Once the first edge is fastened, glue down the other edges while maintaining a top tension on the panel.Next, trim down the ends of the cutout pieces so that they fit over the glued area of the panel. Press each covering strip in place with a liberal amount of hot melt glue. Finally, secure the end of each strip with a nylon blind rivet installed from outside the bucket.Use a utility razor to trim the excess glue and mesh from the edges of the reinforcing strips. The larvae of Crepidula Fornicata appeared to grow faster in the mesocosm relative to the laboratory cultures. The larvae metamorphose spontaneously between the fifth and sixth day.Almost all the larvae had metamorphosed by day seven.