Düşük hacimli ventilasyonlu kültür sisteminin ilk gelişimi, kısmen Ulusal Bilim Vakfı (CRI-OA-1416690'dan Dickinson College'a) tarafından desteklenmiştir. Dr. Lauren Mullineaux, bu sistem için sunulan verilerin toplandığı Woods Hole Oşinografi Enstitüsü'nde laboratuvar olanakları sağladı (Şekil 4).

1. C. fornicata'nın larva kültürlerinin kurulması ve sürdürülmesi için rutin manevralar
NOT: Bu yöntem, kuluçkalık veliger larvalarını yeni salmış yetişkin C. fornicata içeren bir galon (3,8 L) kavanoz deniz suyu ile başlar. Yetişkinler sahada toplanabilir veya Malzeme Tablosunda verilen bir tedarikçiden temin edilebilir. Yetişkinler, çiftleşme yığınlarında yaşayan ve yığının dibinde sapsız kuluçka dişileri olan protandrous hermafroditlerdir. Yetişkin yığınlarını parçalamayın. Üremenin mevsimselliği ve yetişkinlerin mevsim dışı yumurtlama için şartlandırılma yöntemleri daha önce tanımlanmıştır17. Larvalar en iyi şekilde serbest bırakıldıktan sonra 2-3 saat içinde, güçlü bir şekilde jeonegatif olduklarında ve kavanozun yüzeyine yakın yoğunlaştıklarında toplanır.
<ol><li>400 mL'lik üç köşeli tek kullanımlık plastik beherin altını keserek ve 236 μm naylon ağlı bir panele yapıştırarak bir elek yapın. Bu amaçla ve özellikle mezokozm yapımı için (aşağıda), polietilene iyi yapışma için formüle edilmiş sıcakta eriyen bir yapıştırıcı kullanın.</li>
	<li>Yetişkin kavanozunun havasını alın ve 15-20 dakika bekletin, böylece döküntüler çöker ve larvalar yüzeye kolayca yüzebilir.</li>
	<li>Larvaları, 60-80 cm uzunluğundaki yumuşak plastik akvaryum borusunun ucuna yapıştırılmış kısa bir uzunlukta (15-20 cm) 5 mm'lik cam borudan geçirin, yukarıdaki gibi hazırlanan elek içine süzülün, böylece 600 mL'lik bir cam beherde asılı kalın, böylece fazla deniz suyu cam beherden taşar ve larvalar elek üzerinde tutulur. Elek dibini su altında tutun ve larvaların kıvrılmasını önleyin.</li>
	<li>Süzgeci beherden kısa bir süre kaldırın ve larvaları düşük güçlü bir diseksiyon mikroskobu altında manipüle etmek için uygun boyutta bir cam FSW kasesine durulamak için bir fışkırtma şişesi filtrelenmiş deniz suyu (FSW) kullanın. NOT: C. fornicata larvaları, 30 ppt tuzluluğa yakın filtrelenmiş doğal deniz suyunda veya 20-25 °C'de 32 ppt. tuzluluğa kadar yapılan Instant Ocean yapay deniz suyundagelişir 17,18. < 1 μm'de filtrasyon, laboratuvar kültürlerinde sorunlara neden olabilecek kirlenme epizootik protistlerini ortadan kaldırmak için yeterlidir.</li>
	<li>İstenilen sayıda larvayı bir Pasteur pipeti kullanarak bir kültür kavanozuna manuel olarak aktarın ve sayın. En iyi sonuçlar için, C. fornicata'ya 1 larva / 5 mL kültür hacmi kullanın. Larvaları sayın ve sayıları tahmin etme cazibesinden kaçının.</li>
	<li>Kültür başlatıldığında larvaları istenen mikroalg rasyonu ile besleyin ve kültür suyu değiştirildiğinde mikroalgleri gün aşırı değiştirin. NOT: 1 x 105 hücre / mL Isochrysis galbana (T-ISO suşu) diyeti, maksimuma yakın laboratuvar büyüme oranları sağlayan iyi bir standart diyettir. T-ISO kültürü için gıda rasyonu ve yöntemleri daha önceki bir yayındaverilmiştir 17.</li>
	<li>Yukarıdaki adım 1.3'te olduğu gibi, kültürün içeriğini bir beher içindeki bir elek içine dökerek kültür suyunu her gün değiştirin. Süzgeci kaldırın ve larvaları yeni yiyeceklerle taze FSW içeren bir kültür kavanozuna durulamak için bir fışkırtma şişesi FSW kullanın. NOT: En iyi uygulama, larva kültürü için kullanılan herhangi bir cam malzemeyi ayırmak ve bu cam eşyanın fiksatifler, çözünür ağır metal tuzları veya deterjanlarla herhangi bir temasını önlemektir. Rutin temizlik en iyi şekilde bir kabartma tozu macunu (NaHCO3) ve bir naylon ovma pedi ile yapılırken, mineral birikintileri beyaz sirke veya seyreltik HCl içinde hafif asitli bir yıkama ile çıkarılabilir.</li>
</ol>2. C. fornicata larvaları için havalandırmalı kültürlerin yapımı
NOT: Önerilen cam kavanoz (Malzeme Tablosu), deniz suyuna karşı inert olan ve havalandırma gazı akışı için boru diken girişlerini sabitlemek için doğru kalınlığa sahip bir polipropilen kapağa sahiptir.
<ol><li>Her bir kültür kavanozunun kapağına (kapağın iç astarı dahil), her biri kenardan yaklaşık 5 cm uzakta ve birbirinin karşısında 1.5 mm'lik iki delik açın. (13/64 inç emperyal veya # 7 ASME standart makinist matkap ucu da uygun bir boşluk deliği açacaktır).</li>
	<li>Boru dikeni kapağın dış yüzeyinde olacak şekilde 10-32 naylon somun kullanarak her deliğe 1/8 inç x 10-32 dişli naylon boru adaptörü takın.</li>
	<li>Boru adaptörlerinden birinin dişli iç kısmının açıklığına bir miktar silikon kauçuk akvaryum sızdırmazlık maddesi uygulayın ve 20 cm uzunluğunda 2 mm (dış çap) polietilen boruyu içeriden açıklıktan itin, böylece dış açıklığın birkaç mm dışına çıkıntı yapar.</li>
	<li>Borunun sonunda, boru dikeninden çıkıntı yapan küçük bir akvaryum sızdırmazlık maddesi tapası olacaktır, ancak dikenin ucunun hemen ötesinde şeffaf boru görünecektir. Sızdırmazlık maddesinin sertleşmesine izin verin, ardından polietilen borunun çıkıntılı ucunu, boru dikeninin ucuyla aynı hizada olacak şekilde kesin.</li>
	<li>Kültür kavanozunu, kavanozun üst kısmındaki omzun 1 cm yakınına kadar FSW ile doldurun, kapağı vidalayın ve havalandırma havasını veya deneysel gaz karışımı beslemesini polietilen havalandırma borusunu tutan boru dikenine takın. Havalandırma borusunun uzunluğunu, ucu kavanozun dibinde düzgün bir şekilde duracak şekilde kesin.</li>
	<li>Yavaş bir kabarcık akışı elde etmek için havalandırma havası veya gaz karışımının akışını ayarlayın (Şekil 1). Ortam havası ile havalandırma sağlamak için ortak akvaryum çete valflerine sahip bir akvaryum hava pompası kullanın veya diğer deneysel atmosferik gaz karışımları için kütle akış kontrolörleri kullanın14.</li>
</ol>3. C. fornicata larvaları için sahada konuşlandırılabilir bir mezokozm kültürünün inşası
<ol><li>Standart 7 galonluk polietilen kovanın yanlarında her biri 25 cm x 14,5 cm olan 4 eşit aralıklı dikdörtgen açıklık kesin. Her açıklığın altını kovanın iç tabanından yaklaşık 3.5 cm uzağa yerleştirin (Şekil 2A). İnce dişli bıçaklı el tipi bir elektrikli kılıç testeresi bu amaç için idealdir. Kesilen atık parçalarını saklayın ve bir masa testeresi ile uzunlamasına 2 cm genişliğinde şeritler halinde dilimleyin.</li>
	<li>Kovadaki kesme açıklıklarını rahatça üst üste gelecek şekilde (en az 2 cm) sağlamak için her biri en az 30 cm x 20 cm boyutlarında 236 μm naylon ağdan 4 panel kesin. Bir ağ panelinin bir kenarını, küçük yaylı kelepçeler veya mandallar kullanarak oyuğunun uzun bir kenarı üzerine geçici olarak sabitleyin.</li>
	<li>Kafes panelin kenarını, polietilen için formüle edilmiş sıcakta eriyen yapıştırıcı ile kova açıklığına yapıştırın. İlk kenar sabitlendikten sonra, ağ panelinde gergin bir yüzey elde etmek için gerginliği korurken diğer kenarları yapıştırın.</li>
	<li>Ağ panellerinin kova açıklıklarıyla örtüştüğü yapıştırılmış alanı düzgün bir şekilde kaplayacak takviye şeritleri yapmak için kova atık parçalarının şeritlerinin uzunluklarını kesin. Yapıştırıcı sertleşmeden önce her bir şeridi yerine oturtmak için hızlı bir şekilde çalışarak, her bir kaplama şeridini bol miktarda sıcakta eriyen yapıştırıcı ile yerine bastırın.</li>
	<li>Her şeridin ucunu, kovanın dışından takılan bir naylon kör perçin ile sabitleyin. Takviye şeritlerinin dış kenarlarından fazla yapıştırıcıyı ve ağı bir maket tıraş bıçağıyla kesin. NOT: Her perçin için 15/64 inçlik bir pilot delik gerekir. Perçinlerin iç (kör) kısımları, Şekil 2B'de bitmiş mezokozmun iç kısmında görülebilir.</li>
	<li>Mezokozmi, kovanın üst kısmını suyun oldukça üzerinde tutan yüzer bir rafa yerleştirin (Şekil 2C). Gösterilen yüzer raf, 2 inçlik Schedule 40 PVC borunun 30 cm'lik segmentlerinden yapılmıştır, 4 kopya mezokozmun bir sırasını tutabilen hava geçirmez bir yapı oluşturmak için dirsek ve tee bağlantıları ile birlikte çimentoludur.</li>
	<li>Yerel koşullara bağlı olarak, ağ panelleri 1-2 gün içinde deniz suyunun mezokozm yoluyla değişimini engelleyecek şekilde kirlenebilir. Bu meydana geldiği ölçüde, kirlenmiş mezokozmu 2/3 oranındasudan çekerek ve 2 L'lik bir sürahi ile dibinden taze mezokozmosa tekrar tekrar baltalayarak larvaları taze temiz bir mezokozme aktarın.</li>
	<li>Larvaların çoğunu transfer etmek için veya kirlenmiş mezokozmosta larvalar artık gözlenmeyene kadar 20-25 yineleme gerçekleştirin. Ağ panellerini kabartma tozu (NaHCO3) macunu ile doldurulmuş yumuşak bir süngerle nazikçe ovalayarak kirlenmiş mezokozmu temizleyin ve musluk suyuyla durulayın.</li>
</ol>

Crepidula fornicata larvalarının laboratuvar ve tarla koşullarında kültüre alınması

<ol>
	<li>Conklin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryology+of+Crepidula:+a+contribution+to+the+cell+lineage+and+early+development+of+some+marine+gastropods.">The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods.</a> Gasteropods. , (1897).</li><li>Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slipper+snail,+Crepidula:+an+emerging+lophotrochozoan+model+system.">The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li><li>Lyons, D. C., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slipper+snail+tales:+how+Crepidula+fornicata+and+Crepidula+atrasolea+became+model+molluscs.">Slipper snail tales: how Crepidula fornicata and Crepidula atrasolea became model molluscs.</a> Curr Top Dev Biol. 147, 375-399 (2022).</li><li>Blanchard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata+(L.+1758)+in+Europe.+Current+state+and+consequences.">Spread of the slipper limpet Crepidula fornicata (L. 1758) in Europe. Current state and consequences.</a> ScientiaMarina. 61 (Suppl 2), 109-118 (1997).</li><li>Beninger, P., Valdizan, A., Decottigies, P., Cognie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+reproductive+dynamics+of+the+invasive+slipper+limpet,+Crepidula+fornicata.">Field reproductive dynamics of the invasive slipper limpet, Crepidula fornicata.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 390 (2), 179-187 (2010).</li><li>Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+temperature,+growth+rate,+and+duration+of+planktonic+life+for+larvae+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.).">The relationship between temperature, growth rate, and duration of planktonic life for larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 74 (3), 241-257 (1984).</li><li>Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+effects:+surprising+consequences+of+embryonic+and+larval+experience+on+life+after+metamorphosis.">Latent effects: surprising consequences of embryonic and larval experience on life after metamorphosis.</a> Evol Ecol Marine Invertebrate Larvae. , 208-225 (2018).</li><li>Pechenik, J. A., Gee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+metamorphic+competence+in+larvae+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.),+judged+by+a+natural+and+an+artificial+cue.">Onset of metamorphic competence in larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.), judged by a natural and an artificial cue.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 167 (1), 59-72 (1993).</li><li>Taris, M., Comtet, T., Viard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+function+of+nitric+oxide+on+the+onset+of+metamorphosis+in+competent+larvae+of+Crepidula+fornicata:+A+transcriptional+perspective.">Inhibitory function of nitric oxide on the onset of metamorphosis in competent larvae of Crepidula fornicata: A transcriptional perspective.</a> Mar Genomics. 2 (3-4), 161-167 (2009).</li><li>Penniman, J. R., Doll, M. K., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+correlates+of+settlement+in+veliger+larvae+of+the+gastropod,+Crepidula+fornicata.">Neural correlates of settlement in veliger larvae of the gastropod, Crepidula fornicata.</a> Invertebrate Biol. 132 (1), 14-26 (2013).</li><li>Meyer-Kaiser, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carryover+effects+of+brooding+conditions+on+larvae+in+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata.">Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata.</a> Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).</li><li>Noisette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+encapsulation+protect+embryos+from+the+effects+of+ocean+acidification?+The+example+of+Crepidula+fornicata.">Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata.</a> PLoS One. 9 (3), e93021 (2014).</li><li>Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilience+of+Atlantic+slippersnail+Crepidula+fornicata+larvae+in+the+face+of+severe+coastal+acidification.">Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification.</a> Front in Mar Sci. 5, 312 (2018).</li><li>Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legacy+of+multiple+stressors:+Responses+of+gastropod+larvae+and+juveniles+to+ocean+acidification+and+nutrition.">Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition.</a> Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).</li><li>Pechenik, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ocean+acidification+on+growth,+onset+of+competence,+and+perception+of+cues+for+metamorphosis+in+larvae+of+the+slippershell+snail,+Crepidula+fornicata.">Impact of ocean acidification on growth, onset of competence, and perception of cues for metamorphosis in larvae of the slippershell snail, Crepidula fornicata.</a> Mar Biol. 166, 128 (2019).</li><li>Reyes, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marine+gastropod+Crepidula+fornicata+remains+resilient+to+ocean+acidification+across+two+life+history+stages.">The marine gastropod Crepidula fornicata remains resilient to ocean acidification across two life history stages.</a> Front Physiol. 12, 702864 (2021).</li><li>Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+seawater+culture+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+for+studies+of+larval+settlement+and+metamorphosis.+In:+Carroll,+D.,+Stricker,+S.+(eds)+Developmental+biology+of+the+sea+urchin+and+other+marine+invertebrates.">Artificial seawater culture of the gastropod Crepidula fornicata for studies of larval settlement and metamorphosis. In: Carroll, D., Stricker, S. (eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates.</a> Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).</li><li>Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interactive+influence+of+temperature+and+salinity+on+larval+and+juvenile+growth+in+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.).">The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).</li><li>Strathmann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae. , (1987).</li><li>Clark, H. R., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+fluctuations+in+CO2+and+dissolved+oxygen+concentrations+do+not+provide+a+refuge+from+hypoxia+and+acidification+for+early-life-stage+bivalves.">Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves.</a> Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114 (2016).</li><li>Gobler, C. J., Baumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+acidification+in+ocean+ecosystems:+coupled+dynamics+and+effects+on+marine+life.">Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life.</a> Biol Lett. 12 (5), 20150976 (2016).</li><li>Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+larval+and+juvenile+growth+rates+in+two+marine+gastropods,+Crepidula+plana+and+C.">Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C.</a> fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).</li><li>Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+food+on+metamorphic+competence+in+the+model+system+Crepidula+fornicata.">Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata.</a> Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).</li><li>Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coastal+ocean+acidification:+the+other+eutrophication+problem.">Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem.</a> Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).</li></ol>

Bildirilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

C. fornicata larvalarının kültüre alınması diğer planktotrofik deniz larvalarına kıyasla nispeten daha kolay olmasına rağmen, iyi kültür uygulamalarının temellerine dikkat etmek hala önemlidir17,19. Sağlıklı larvalar yumurtadan çıktıktan hemen sonra beslenmeye başlamalıdır. Bu, yumurtadan çıktıktan sonraki gün, transillüminasyonlu bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, alg hücreleriyle dolu bağırsaklarını gözlemleyerek ...

Terlik limpeti, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), gelişimsel bir model olarak faydası ve istilacı bir tür olarak yaygın etkileri nedeniyle güncel ve tarihsel araştırma literatüründe iyi temsil edilmektedir. Deneysel embriyolojinin klasik çağındaspiral gelişimin temel bir örneği olarak hizmet etti 1 ve lophotrochozoan erken gelişim 2,3 mekanizmalarını incelemek için modern görüntüleme ve genomik araçların uygulanmasıyla yeniden bir ilgi doğuşu yaşadı. Yaşam tarihinin diğer ucunda, diğer araştırmalar, bu ekosistem mühendisinin yetişkin popülasyonlarının, doğu Kuzey Amerika'daki orijinal dağılımından çok uzakta olan ılıman kıyı deniz ortamlarındaki etkilerine odaklanmıştır 4,5. Embriyo ve yetişkin arasında, bu türün veliger larvaları, larva gelişimi ve ekolojisi, özellikle büyümeyi etkileyen faktörler ve metamorfoz için yeterlilik kazanılması, larva yerleşimine aracılık eden iç ve dış ipuçları ve larva deneyiminin gençlik performansı üzerindeki etkileri hakkında çok sayıda çalışmanın konusu olmuştur 6,7,8,9,10,11 . Son zamanlarda yapılan çalışmalar, C. fornicata'nın larvalarının ve yavrularının okyanus asitlenmesine karşı direncini ortaya koymuştur, bu da bu hayvanın üretken araştırma kullanımı için başka bir yol 12,13,14,15,16.
Deniz larva biyolojisi çalışmaları için C. fornicata'nın bir avantajı, kamçılı Isochrysis galbana'nın tek algal bir diyetinde doğal veya yapay deniz suyunda laboratuvarda yetiştirilmesinin nispeten kolay olmasıdır. Kültür yöntemleri, yazar tarafından daha önceki yöntem odaklı bir basılı yayında detaylandırılmıştır17. Mevcut katkının nedenleri iki yönlüdür. Birincisi, kültürlerin kurulması ve bakımıyla ilgili rutin fiziksel manevralar kavramsal olarak çok basittir, ancak uygulamalı veya video gösterimi olmadan doğru bir şekilde gerçekleştirilmesi zordur. İkinci olarak, daha önce açıklanan kültür yöntemlerinde, özellikle okyanus asitlenmesi, ötrofikasyon ve oksijen tükenmesi gibi çevresel stres faktörlerine verilen tepkilerin laboratuvar ve saha çalışmaları için uygun olan iki varyasyon tanımlanmıştır. Bunlardan ilki, küçük hacimlerde kabarcıklı gazlar aracılığıyla deniz suyundaki pH ve çözünmüş oksijenin manipülasyonu için uygun düşük hacimli (800 mL) bir kültür sistemi, ikincisi ise sahaya yerleştirilebilen ve ortamdaki deniz suyunun serbest değişimine izin veren daha büyük hacimli (15 L) bir mezokozm sistemidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bucket, Polyethylene, 7 gallon</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>16916</td>
			<td>for mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crepidula fornicata</td>
			<td>Marine Biological Laboratory, Marine Resources Center</td>
			<td>760</td>
			<td>adult broodstock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotmelt glue, Infinity Supertac 500</td>
			<td>Hotmelt.com</td>
			<td>INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB</td>
			<td>good for bonding polyethylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar, glass, 32 oz, with polypropylene lid</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-19316P-W</td>
			<td>for 800 mL ventilated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh, 236 &#181;m</td>
			<td>Dynamic Aqua Supply Ltd.</td>
			<td>NTX236-136</td>
			<td>for mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, hex, nylon, 10-32 thread</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>1004554441</td>
			<td>for fastening tubing barbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivets, nylon, blind, 15/64&#34; diameter, 5/32&#34;-5/16&#34; grip range, pack of 8</td>
			<td>NAPA auto parts</td>
			<td>BK 6652844</td>
			<td>4 packs needed per mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing barb 1/8&#34; x 10-32 thread</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65593</td>
			<td>2 needed per culture jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, polyethylene, 2.08 mm OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11G</td>
			<td>for ventilating gas stream inside culture jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Tygon, 1/8&#34;x3/16&#34;x1/32&#34;</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>57810</td>
			<td>fits barbs for ventilating cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory and field culture of larvae of the slipper limpet, crepidula fornicata

Calyptraeid gastropod yumuşakçası, Crepidula fornicata, larva gelişim biyolojisi, fizyolojisi ve ekolojisi çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu türün kuluçkadaki veliger larvaları, erginler tarafından doğal olarak salındıktan sonra bir elek üzerine sifonlanarak toplanmış, 200/L yoğunlukta kültüre dağıtılmış ve 1 x 105 hücre/mL'de Isochrysis galbana (suş T-ISO) ile beslenmiştir. Ortam havasına veya tanımlanmış atmosferik gaz karışımlarına dengeleme için tasarlanmış havalandırmalı 800 mL kültürlerde yetiştirilen kardeş larvalar için kabuk büyümesi ve metamorfoz için yeterlilik kazanılması belgelenmiştir. Bu laboratuvar kültürü koşullarının aksine; Üreme yetişkinlerinden oluşan bir tarla popülasyonunda bulunan 15 L'lik akışlı bir ortam deniz suyu mezokozmunda yetiştirilen larvalar için de büyüme ve yeterlilik verileri toplanmıştır. Laboratuvar kültürlerinde metamorfik yeterliliğin büyüme oranları ve zamanlaması, daha önce yayınlanmış çalışmalarda bildirilenlere benzerdi. Mezokozm tarlasında yetiştirilen larvalar, herhangi bir laboratuvar çalışması için bildirilenden çok daha hızlı büyüdü ve daha erken metamorfoza uğradı. Birlikte, bu yöntemler, laboratuvarda önceden belirlenmiş kontrollü koşullar altında ve tarlada doğal olarak oluşan koşullar altında larva gelişimini araştırmak için uygundur.

The slipper limpet, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), is well-represented in current and historical research literature because of its utility as a developmental model and because of its widespread impacts as an invasive species. It served as a foundational example of spiralian development in the classic age of experimental embryology1 and has experienced a rebirth of interest with the application of modern imaging and genomic tools to dissect mechanisms of lophotrochozoan early development2,3. At the other end of its life history, other investigations have focused on the impacts of adult populations of this ecosystem engineer in temperate coastal marine environments far removed from its original distribution in eastern North America4,5. In between embryo and adult, the veliger larvae of this species have been subjects of numerous studies of larval development and ecology, especially of factors influencing growth and acquisition of competence for metamorphosis, the internal and external cues mediating larval settlement, and the effects of larval experience on juvenile performance6,7,8,9,10,11. Recent studies have revealed the resilience of larvae and juveniles of C. fornicata to ocean acidification, yet another avenue for productive research use of this animal12,13,14,15,16.
An advantage of C. fornicata for studies of marine larval biology is that it is relatively easy to grow in the laboratory in natural or artificial seawater on a unialgal diet of the flagellate Isochrysis galbana. Culture methods have been detailed by the author in an earlier methods-focused print publication17. The reasons for the present contribution are twofold. First, the routine physical maneuvers involved in establishing and caring for cultures are conceptually very simple but difficult to perform correctly without hands-on or video demonstration. Second, two variations on previously described culture methods are described that are especially suited to laboratory and field studies of responses to environmental stressors such as ocean acidification, eutrophication, and oxygen depletion. The first of these is a low-volume (800 mL) culture system suited for manipulation of pH and dissolved oxygen in seawater via small volumes of bubbled gases, and the second is a larger volume (15 L) mesocosm system that can be placed in the field and that allows free exchange of ambient seawater.

Yazar Gündemi: Larva Ekolojisi Araştırmalarında Saha Gözlemleri ve Laboratuvar Manipülasyonları Arasındaki Boşluğu Kapatmak

Terlik Limpeti (Crepidula fornicata) Larvalarının Laboratuvar ve Saha Kültürü

Larva büyümesi ve metamorfoz için yeterlilik kazanımı, her biri 160 larva içeren, tek bir yumurta kütlesinden yumurtadan çıkan ve 1 x 105 hücre / mL yoğunlukta Isochrysis galbana ile beslenen bir kardeş larva grubundan türetilen 800 mL ventilasyonlu kültürün 4 eşzamanlı kopyasında ölçülmüştür. PH 7.9-8.0, sıcaklık 20-21 °C ve tuzluluk 30-31 ppt idi. Büyüme ve metamorfoz, Buzzards Bay, MA, ABD'de laboratuvar kültürleriyle benzer pH, sıcaklık ve tuzluluk koşulları alt...

Read this Scientific Article Protocol about Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata at JoVE.com

Makale, gastropod Crepidula fornicata'nın larva kültürü için yöntemleri küçük hacimli laboratuvar ölçekli bir sistemde ve sahada konuşlandırılabilen bir ortam-deniz suyu mezokozm sisteminde sunmaktadır.

The calyptraeid gastropod mollusk, Crepidula fornicata, has been widely used for studies of larval developmental biology, physiology, and ecology. Brooded ...

Deniz larvalarının gelişiminin çoklu çevresel faktörler ve stres faktörlerinden nasıl etkilendiği ve larva sinir sisteminin larvaların yerleşimini, bentik gençlere metamorfozu ve yetişkin popülasyonlara katılımı düzenlemek için çevreden gelen bilgileri nasıl bütünleştirdiği ile ilgileniyorum. Terlik Limpet, Crepidula Fornicata gibi bazı deniz türlerinin larvaları, okyanus asitlenmesine karşı oldukça dirençlidir, ancak asitlenme ile beslenme ve tuzluluk gibi diğer faktörler arasında önemli etkileşimler vardır. Larvaların doğada nasıl büyüdüğü, geliştiği ve davrandığı hakkında çok fazla şey bilmiyoruz.Alan mezokozm gözlemleri bu boşlukların bazılarını doldurabilir ve laboratuvar manipülasyonları ile test etmek için hipotezler önerebilir. Nörodavranışsal, gelişimsel ve transkripsiyonel seviyelerde, larvaların, insan etkilerine özellikle duyarlı olan verimli kıyı ortamlarında kısa zaman ölçeklerinde değişen stres faktörleriyle nasıl başa çıktıklarını sormaya başlayabiliriz.

laboratory-field-culture-larvae-slipper-limpet-crepidula

Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata

229 Görüntüleme.  Dickinson College. Deniz larvalarının gelişiminin çoklu çevresel faktörler ve stres faktörlerinden nasıl etkilendiği ve larva sinir sisteminin larvaların yerleşimini, bentik gençlere metamorfozu ve yetişkin popülasyonlara katılımı düzenlemek için çevreden gelen bilgileri nasıl bütünleştirdiği ile ilgileniyorum. Terlik Limpet, Crepidula Fornicata gibi bazı deniz türlerinin larvaları, okyanus asitlenmesine karşı oldukça dirençlidir, ancak asitlenme ile beslenme ve tuzluluk gibi di?...

Video: Yazar Gündemi: Larva Ekolojisi Araştırmalarında Saha Gözlemleri ve Laboratuvar Manipülasyonları Arasındaki Boşluğu Kapatmak

The calyptraeid gastropod mollusk, Crepidula fornicata, has been widely used for studies of larval developmental biology, physiology, and ecology. Brooded veliger larvae of this species were collected by siphoning onto a sieve after natural release by adults, distributed into the culture at a density of 200/L, and fed with Isochrysis galbana (strain T-ISO) at 1 x 105 cells/mL. Shell growth and acquisition of competence for metamorphosis were documented for sibling larvae reared in ventilated 800 mL cultures designed for equilibration to ambient air or to defined atmospheric gas mixtures. Contrasting with these laboratory culture conditions; growth and competence data were also collected for larvae reared in a 15 L flow-through ambient seawater mesocosm located in a field population of reproductive adults. Growth rates and timing of metamorphic competence in the laboratory cultures were similar to those reported in previously published studies. Larvae reared in the field mesocosm grew much faster and metamorphosed sooner than reported for any laboratory studies. Together, these methods are suited for exploring larval development under predetermined controlled conditions in the laboratory as well as under naturally occurring conditions in the field.

The paper presents methods for larval culture of the gastropod Crepidula fornicata in a small-volume laboratory-scale system and in an ambient-seawater mesocosm system that can be deployed in the field.